INTRODUCCIÓN
La Paramfistomosis es una enfermedad
parasitaria ocasionada por
trematodos que afectan a rumiantes y diversas especies silvestres,
especialmente en regiones tropicales (Rojas et al., 2015). Puede causar una gastroenteritis aguda y
anemia con alta morbilidad especialmente en animales jóvenes (Kifleyohannes
et al., 2015). Este trematodo puede
causar cuantiosas pérdidas económicas que se enmarcan en reducciones en la
producción de lana, carne y leche.
Rangel-Ruiz, Albores-Brahms y
Gamboa-Aguilar (2003) y Silva (2006) resaltan que se trata de una enfermedad
emergente puesto que se conoce de su extensión. Este incremento puede ser
debido a una sobreestimación de la prevalencia de Fasciola hepatica en regiones con geografía donde coexisten
simultáneamente ambos trematodos. Así como, a la no disponibilidad de fármacos
eficaces en el tratamiento de la paramfistomosis en nuestro medio (Pinedo et al., 2010).
El diagnóstico clínico de Paramphistomum es muy difícil debido a
la falta o parecido de signos con otras parasitosis. Los métodos inmunológicos
y la detección de anticuerpos en el suero todavía no son concluyentes para el
diagnóstico del parásito (Rieu et al., 2007). Asimismo, el diagnóstico de este parásito
se hace de forma rutinaria y consiste en la demostración de huevos en las heces
de los bóvidos infestados, con la técnica coprológica de sedimentación (Piña, 2013;
Silva, 2006).
McMaster es una técnica muy utilizada
en los laboratorios veterinarios ya que es
posible variarla por el volumen de las heces a examinar (Bosco, 2014). Mini-Flotac es una nueva técnica de la familia de las
FLOTAC (Godber et al.,
2015) y fue introducida en los
últimos tiempos como una alternativa a McMaster (Cringoli et al.,
2010). Para nuestro conocimiento
no existen informes del empleo de Mini-Flotac en el diagnóstico de Paramphistomum
spp.
El diagnóstico de trematodos digeneos que
existe en Cuba es escaso, a esto se le añade el hecho que existen pocos
estudios específicos para el tratamiento y control de esta trematodiasis en
rebaños bovinos afectados por este parásito en nuestro país (Vázquez et al.,
2015). Si tenemos en cuenta además que el método de
diagnóstico usado en Cuba para la detección de huevos de trematodos es el de
sedimentación simple, método coprológico cualitativo de baja fiabilidad, se
hace necesario buscar métodos alternativos más fiables.
Por lo anteriormente expuesto en el trabajo
nos proponemos como objetivo comparar
el desempeño de las técnicas coprológicas McMaster y Mini- FLOTAC en el
diagnóstico de Paramphistomum spp. de
muestras provenientes de bovinos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para
cumplir los objetivos del presente trabajo se realizaron dos experimentos. En
el primero se evaluó la recuperación de huevos de Paramphistomum spp. en muestras de heces
fecales con cantidades conocidas de huevos por gramos de heces, con el empleo
de diferentes soluciones de flotación. En el segundo se tomaron muestras de
heces fecales de bovinos destinados al sacrificio y bovinos provenientes de
rebaños lecheros, para comparar las técnicas de McMaster y Mini- Flotac en el
diagnóstico de Paramphistomum spp.
Toma de muestras
Las
muestras de heces fecales de bovinos destinados al sacrificio se obtuvieron en
el matadero sanitario Guanamaquilla del municipio de
Camagüey, se tomaron un total de 40 muestras directamente del recto de los
animales. Además, se tomaron muestras de heces, de 155 rebaños de vacas en ordeño, provenientes de la Empresa Pecuaria Triángulo 3
del municipio Camagüey. De cada rebaño se colectaron al azar heces de 20 vacas
en ordeño y se unieron cantidades iguales en peso para formar la muestra del
rebaño.
Todas
las muestras fueron selladas en bolsas de polietileno, identificadas y
refrigeradas. Posteriormente se trasladaron al Laboratorio de Parasitología de
la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Camagüey.
Colecta de huevos y
preparación de muestras conocidas.
Directamente del rumen de los bovinos sacrificados
se tomaron aproximadamente 15 Paramphistomum spp. adultos vivos. Se lavaron con NaCl al 0,9 %
y se colocaron en vasos de precipitado de cristal de 400 mL, con solución de
PBS 1X (KH2PO4
1,8 mmol/L; Na2HPO4 8,4 mmol/L; KCl 12,6 mmol/L y NaCl
136,8 mmol/L, pH 7,2).
Los trematodos se mantuvieron a temperatura ambiente
durante su traslado al Laboratorio de Parasitología de la Universidad de
Camagüey. Posteriormente se realizó un último lavado con PBS 1X para eliminar
restos de sangre y contenido ruminal. Se incubaron en vaso precipitado con 100
mL de PBS 1X durante 4 horas a 37 ºC para la ovoposición. Luego se retiraron
los individuos, y los huevos se obtuvieron por decantación del sobrenadante,
hasta un volumen final de 10 mL de solución de PBS 1X. El conteo de huevos se
realizó con cinco réplicas de 100 µL.
Preparación de las muestras de heces con cantidades conocidas de
huevos del tremado.
El contenido en el vaso precipitado con los huevos
de Paraphistomum spp. se decantó
hasta 5 mL y se volvió a realizar el conteo de huevos. La concentración de
huevos se ajustó a 1000 hpg en heces (previamente esterilizadas en autoclave a
121 ºC y 1 atm durante 15 minutos) libres de huevos del parásito. Se realizaron
diferentes diluciones con heces libres de huevos para concentraciones conocidas
de 5, 25, 125, 250, 500 y 1000 de hpg.
Comparación de
soluciones de flotación para la detección de huevos de Paraphistomum spp.
Se tomaron tres gramos de heces de cada
concentración conocida de hpg y se le añadieron 27 mL (dilución 1:10) de una de
las siguientes soluciones de flotación: ZnSO4 1,45 g/mL, ZnCl2
1,45 g/mL, ZnCl2 1,5 g/mL y ZnCl2 + Sacarosa 1,5 g/mL. Posteriormente
se mezclaron y se filtraron en un tamiz 1 mm. La suspensión se homogenizó y se
llenaron las cámaras de Mini-Flotac y McMaster. Las cámaras se dejaron reposar
al menos por 10 minutos y se observaron al microscopio (10X) para el conteo de
huevos. Los factores de dilución fueron de 5 para Mini-Flotac y 10 para
McMaster. Se consideró como muestra positivala que tuviera al menosun huevo de Paramphistomum spp.
Determinación
de Paramphistomum spp. por conteo de
hpg en bovinos destinados al sacrificio y rebaños lecheros.
A las 40 muestras de heces fecales de bovinos
destinados al sacrificio, y las 155 de rebaños de vacas en ordeño, se les
realizaron tres réplicas de cada una de las técnicas coprológicas en estudio,
para un total de seis conteos por muestras. Se
tomaron tres gramos de materia fecal de cada grupo por unidad o réplica de las
heces de los animales sacrificados, y se diluyeron en 27 mL de solución
saturada de sacarosa con ZnCl2 con una densidad de 1,52 g/mL.
Posteriormente, se desarrolló el procedimiento descrito en la sección anterior.
Análisis
estadístico.
Se
utilizó el paquete estadístico Graphpad Prism 7.0 (2016) para los análisis de
regresión entre McMaster y Mini-Flotac, y de hpg conocido y observado. Para la comparación de los
CV (%) se utilizó el ANOVA bifactorial, los factores estudiados fueron la
técnica utilizada y la densidad. El valor de exactitud se obtuvo según el
valor de recuperación de las pendientes de la regresión lineal entre el hpg
conocido y el observado. El porciento de precisión para cada técnica se calculó
por la sustracción al 100 por ciento del CV (%). La
Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Negativo (VPN), Valor Predictivo
Positivo (VPP) y la prevalencia se determinaron mediante el software online
MedCalc Software bvba, Ostend, Belgium.
RESULTADOS
Análisis
de recuperación de huevos de Paramphistomum de muestras de heces
Las técnicas coprológicas como McMaster (McM) y Mini- FLOTAC (MF)
mostraron una amplia gama de posibilidades para el diagnóstico de Paramphistomum spp. en bovinos a
diferentes concentraciones de hpg
(5, 25, 125, 250, 500 y 1000)
y densidades (1,45 y 1,5 g/mL) como muestra la figura 1.
2020.%20McMaster%20y%20Mini-Flotac_archivos/image004.png)
Figura 1.
Determinación de huevos de Paramphistomum
spp. en muestras de heces fecales con cantidades conocidas de huevos del
parásito (hpg conocido, en el rango de 5- 1000). McM (McMaster), MF (Mini-
FLOTAC).
Las
pendientes indican similares valores de recuperación en las técnicas McMaster y
Mini-Flotac. Sin embargo, las soluciones de ZnSO4 en la densidad de
1,45 g/mL presentaron
valores más bajos de recuperación con ambas cámaras, que el resto de las
soluciones. Los porcientos de recuperación de las soluciones de ZnCl2
estuvieron entre el 59 y 70 % (Tabla 1).
Tabla 1. Ecuaciones que describen la detección de
huevos de Paramphistomum spp. en
heces con cantidades conocidas de huevos del parásito.
|
Solución de flotación
|
Densidad (g/mL)
|
Ecuación
|
R2
|
|
McM ZnCl2
|
1,45
|
Y= 0,69*X - 3,81
|
0,94
|
|
MF ZnCl2
|
1,45
|
Y= 0,70*X – 8,15
|
0,97
|
|
McMZnSO4
|
1,45
|
Y= 0,40*X – 1,43
|
0,97
|
|
MF ZnSO4
|
1,45
|
Y= 0,37*X – 0,74
|
0,98
|
|
McM ZnCl2
|
1,50
|
Y= 0,66*X – 4,98
|
0,97
|
|
MF ZnCl2
|
1,50
|
Y= 0,77*X – 20,15
|
0,98
|
|
McM ZnSO4
|
1,50
|
Y= 0,69*X – 12,68
|
0,96
|
|
MF ZnSO4
|
1,50
|
Y = 0,59*x – 7,19
|
0,98
|
MF: Mini- FLOTAC,
McM: McMaster Y= Cantidad de huevos por gramos de heces
observados,
X = cantidad de huevos por gramos de heces
conocidos.
Los coeficientes de variación (CV) para las técnicas en estudio fueron
similares (Tabla 2).
Tabla 2. Coeficiente de variación (CV) y precisión de McMaster y Mini- FLOTAC
con diferentes soluciones de flotación.
|
Solución
|
Densidad (mg/mL)
|
CV (%)
|
Precisión (%)
|
|
McM ZnCl2
|
1,45
|
21,32
|
78,68
|
|
MF ZnCl2
|
1,45
|
22,02
|
77,98
|
|
McMZnSO4
|
1,45
|
16,93
|
83,07
|
|
MF ZnSO4
|
1,45
|
25,05
|
74,95
|
|
McM ZnCl2
|
1,50
|
21,72
|
78,28
|
|
MF ZnCl2
|
1,50
|
17,83
|
82,17
|
|
McM ZnSO4
|
1,50
|
25,83
|
74,62
|
|
MF ZnSO4
|
1,50
|
19,01
|
80,99
|
MF: Mini- FLOTAC, McM: McMaster.
Comparación
Los valores de hpg detectados por ambas
técnicas presentaron relación lineal (R2
= 0,93). La pendiente de la regresión mostró un valor de 1,36 lo que indica que
Mini-Flotac logró detectar un 36 % más de huevos que McMaster (Figura 2).
2020.%20McMaster%20y%20Mini-Flotac_archivos/image006.png)
Figura
2.
Detección de huevos por gramos de heces de Paramphistomum
spp. con McMaster (McM-X) y Mini- FLOTAC (MF-Y) en
la solución de flotación: ZnCl2 (1,45 g/mL), MF = 1,36*McM - 4,11. R2 =0,93 (n=40).
En la solución de flotación de ZnCl2 y la densidad de 1,5 se
encontraron valores similares para sensibilidad, especificidad y valores
predictivos positivos y negativos en la detección de huevos de Paramphistomum spp. por ambos métodos (Tabla
3).
Tabla 3.
Sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la detección del conteo de
huevos determinados con McMaster y Mini- FLOTAC.
|
|
McMaster ZnCl2 1,50 g/mL
|
Mini- FLOTAC ZnCl2 1,50 g/mL
|
|
Sensibilidad
|
77,38% [66,95% -85,80%]
|
77,38% [66,95%- 85,80%]
|
|
Especificidad
|
91,67% [77,53%- 98,25%]
|
91,67% [77,53- 98,25%]
|
|
Valor
Predictivo Negativo
|
63,46% [53,60%- 72,31%]
|
63,46% [53,60%- 73,61%]
|
|
Valor
Predictivo Positivo
|
95,59% [53,60%- 98,47%]
|
95,59% [¨87,93%-98,47%]
|
[Intervalo de confianza 95 %]
La figura 3 representa el análisis de
regresión lineal para las muestras provenientes de rebaños lecheros, la
ecuación que lo describe es: MF = 0,76*McM + 1,38, (R2= 0,71). La pendiente indica
que detectó Mini- FLOTAC un 24 % menos que McMaster.
2020.%20McMaster%20y%20Mini-Flotac_archivos/image008.png)
Figura 3. Detección
de huevos de Paramphistomum spp. por
gramos de heces bovinas (muestras de rebaños lecheros). McMaster (McM) y
Mini-Flotac (MF), Solución de flotación ZnCl2 (1,50 g/mL), MF = 0,76*McM + 1,38 (R2= 0,71)
(n=155).
Los
valores de prevalencia en la detección de huevos de Paramphistomum spp.
para rebaños lecheros fue para McMaster 42,9 y para Mini- FLOTAC 43,5. Ambas técnicas coprológicas
mostraron alta sensibilidad, aunque Mini-Flotac mostró una tendencia a mayor
por ciento (91,1 %) comparada con McMaster (87 %). De igual forma el valor
predictivo negativo fue superior en Mini-Flotac (91,9 %) que McMaster (88,7 %).
No se detectaron falsos positivos en el
análisis de las muestras (Tabla 4).
Tabla 4.
Sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la detección del conteo de
huevos determinados con McMaster y Mini-FLOTAC de Paramphistomum spp. en muestras
heces bovinas de rebaños lecheros.
|
|
MacMaster
|
Mini- FLOTAC
|
|
Sensibilidad
|
86,99% [80,57% -91,51%]
|
91,1% [85,36%- 92,74%]
|
|
Especificidad
|
100% [97,49%-
100%]
|
100% [97,49- 100%]
|
|
Valor
Predictivo Negativo
|
88,69% [83,01%- 92,64%]
|
91,98% [86,76%- 95,25%]
|
|
Valor
Predictivo Positivo
|
100% [97,06%- 100%]
|
100% [¨97,19%-100%]
|
[Intervalo de confianza al 95 %]
DISCUSIÓN
Los
estudios para evaluar la exactitud y precisión en la detección de huevos de
parásitos en animales se basan en muestras de heces de individuos infestados
natural o experimentalmente (Ojeda-Robertos et
al., 2014).
Por esta razón el número real de huevos podría ser incorrecto. En nuestro
trabajo las muestras se prepararon con un número conocido de huevos del
parásito, lo que permitió determinar la verdadera precisión y exactitud de las
técnicas en el diagnóstico de Paramphistomum
spp. en bovino.
La exactitud en
los conteos de huevos es imprescindible al evaluar el fenómeno de resistencia
parasitaria frente a los antihelmínticos (Eysker y
Ploeger, 2000). El incremento de la exactitud ayuda,
además, a la predicción positiva en muestras con pocas cantidades de huevos,
con menor variabilidad (Barda et al., 2013; De Castro et al., 2017). Métodos de conteo de huevos más exactos y
precisos permiten obtener diagnósticos más fiables y evaluar mejor la
efectividad de los tratamientos antiparasitarios.
En el presente trabajo ambas técnicas
mostraron similares exactitud y precisión, con muestras conocidas de hpg,
independientemente de la solución de flotación. Los bajos CV y alta precisión
en McMaster pueden estar dados porque se empleó 10 como factor de dilución y
las lecturas incluyeron toda el área de las cámaras. Se conoce que la exactitud
y precisión en McMaster están directamente relacionada con el área de lectura (Cringoli et al., 2004).
Existen evidencias de estudios que comparan
las técnicas de Mini-Flotac
y McMaster en el diagnóstico de huevos de nematodos en ganado
bovino y helmintos en humanos
(Bosco, 2014;
Glinz et al., 2010). Silva et al. (2013) detectaron que la exactitud de McMaster y
Mini–FLOTAC son similares. Sin embargo, se reportan menores coeficientes de
variación en Mini-Flotac comparado con McMaster, en la detección en parásitos
gastrointestinales para equinos (Noel et al., 2017).
La
recuperación de huevos de Paramphistomum
spp. en bovinos detectados en nuestro estudio con el uso de las técnicas
McMaster y Mini-Flotac fueron similares a los reportados por Rinaldi et al.
(2014). Los autores evaluaron estas
técnicas en muestras de heces agrupadas de ovinos en la detección de huevos de
strongylus gastrointestinales. Asimismo, nuestros resultados de recuperación de
huevos de parásitos comparando ambas técnicas son superiores a los descritos en
otros estudios (Noel et al.,
2017). Estudios similares en
ovinos demostraron que Mini-Flotac
resultó mejor en la detección de huevos de parásitos gastrointestinales en esta
especie (Rinaldi et al.,
2014; Silva et al., 2013).
La
técnica McMaster es el método de diagnóstico coprológico más utilizado
universalmente en parasitología veterinaria (Vadlejch et al.,
2011). En experimentos de comparación
entre McMaster y Mini- FLOTAC en el diagnóstico de huevos de Eimeria spp. en ovinos infestados de
forma natural, Mini-Flotac proporcionó valores más altos de hpg (P< 0,05),
que McMaster (Silva et al.,
2013). Los valores de hpg con Mini-Flotac
obtenidos en nuestro estudio parecen un poco contradictorios, en el caso de las
muestras de los bovinos a sacrificio fue mayor en Mini-Flotac; sin embargo, en
muestras agrupadas de rebaños lecheros los conteos de McMaster fueron
superiores. La densidad de la solución de flotación empleada, así como el tipo
y/o consistencia de las heces pueden influir en el diagnóstico parasitológico (Cringoli et al., 2010). Las
muestras provenientes de los rebaños lecheros tuvieron menos carga parasitaria,
atribuible a que fueron agrupadas, lo cual pudiera reducir la precisión del
diagnóstico y similitud entre ambas técnicas.
Experimentos de comparación entre conteos
fecales de huevos de nematodos gastrointestinales a través del empleo de
McMaster y Mini-Flotac para equinos y bovinos muestran resultados de hpg
similares en ambas técnicas. Sin embargo, los CV fueron significativamente más
bajos para Mini-Flotac; por lo que los autores recomendaron esta técnica en
animales con conteo fecales bajos (De Castro et al.,
2017). Las dificultades con los métodos coprológicos
reclaman la necesidad de métodos más sensibles que permitan un diagnóstico más
certero de la infestación de Paramphistomum
en vacas y su impacto económico (Rieu et al.,
2007).
Existe un aumento del número de estudios sobre la prevalencia
de Paramphistomum spp. debido a la reducción que ocasiona el parásito en
la productividad ganadera. En el distrito de Moyabamba, Perú, las prevalencias
del parásito fueron de un 55 % en rebaños lecheros (Rojas et al., 2015). De igual manera, en Holanda detectaron prevalencias
entre el 82,6 y el 83,3 % (Ploeger et al., 2015), valores superiores a los detectados en el presente
trabajo. La alta prevalencia de Paramphistomum spp. encontrada en nuestro estudio puede estar relacionada con la presencia de
biotopos en las áreas de pasturas; además, todas las categorías de animales
pastan juntas, sin embargo, es necesario realizar un estudio de riesgo que
permita la toma de medidas en el control de la paramfistomosis.
CONCLUSIONES
Ambas técnicas coprológicas tienen alta
precisión y recuperación en
la detección de huevos de Paramphistomum
spp. en heces de bovinos, lo que indica la
aplicabilidad para el diagnóstico parasitológico.
REFERENCIAS
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Contribución de los autores
La participación de los autores fue la siguiente:
Concepción y diseño de la investigación: EC, MG y AA. Análisis e interpretación
de los datos: EC, ZG, JM y AA. Redacción del artículo: EC, AD y AA
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Marbelys González Salotén*