RESUMEN
Antecedentes: El uso de la biomasa comestible de Dichrostachys cinerea
podría ser una alternativa eficaz para el control de parasitosis en animales. Objetivo. Evaluar la toxicidad a dosis
límite de un extracto de legumbres, rebrote y hojas de planta adulta de D. cinerea en
ratas. Métodos: Se utilizaron ratas
adultas jóvenes de la especie Rattus norvegicus (variedad albina), de la línea o cepa Sprague Dawley (Cenp: SD), de ambos sexos, con un peso entre 150 y 200 g,
consanguíneas y heteroxénicas. Se evaluaron tres extractos acuosos mediante maceración al 20% de
biomasa vegetal de, rebrotes, hojas de planta adulta y legumbres, mediante el
ensayo de toxicidad oral por dosis límite de 2000 mg / kg de masa corporal. Se
controló la ocurrencia de mortalidad y la aparición de síntomas o signos de
toxicidad. Se practicó necropsia y análisis macroscópico a los animales al
final del estudio en busca de lesiones. Se empleó el paquete estadístico
STATISTICA, versión 10 y se aplicaron los ensayos no paramétricos de Pares de Wilcoxon y U de Mann Whitney, para comparar el peso inicial
y final por sexos y el incremento por sexos, respectivamente. Resultados: Las ratas de ambos sexos
incrementaron su masa corporal, lo que demuestra la no influencia negativa por
la administración del extracto. Se observó diferencias significativas en el
incremento de peso entre hembras y machos, no se observaron lesiones
macroscópicas o alteraciones patológicas relacionadas o achacables a la
administración del producto.
Conclusiones: El extracto acuoso de legumbres, rebrote y hojas de la planta
D. cinerea,
no resulta tóxico a dosis límite oral en ratas.
Palabras clave: dosis límite, legumbre, planta, rebrote (Fuente: BVS)
ABSTRACT
Background: The utilization of edible
biomass of Dichrostachys cinerea could become an effective alternative for the
control of animal parasitosis. Aim. To evaluate toxicity at a limit dose
of an extract of legumes, reshoots, and leaves of adult D. cinerea plants in rats. Methods: The
study comprised young-adult albino consanguineous and heteroxenic
rats (Rattus norvegicus)
of the Sprague Dawley (Cenp: SD) line, of both sexes,
weighing between 150 and 200 g. Three aqueous extracts by 20% crushing
from plant biomass, reshoots from the adult plants, and legumes were evaluated
through an oral toxicity test with a limit dose of 2000 mg/kg body mass.
Mortality and symptoms or signs of toxicity were controlled. A necropsy and
microscopic analysis of the animals at the end of the study was performed to
detect lesions. STATISTICA, version 10, was used, and the Wilcoxon and Man
Whitney U non-parametric paired tests were performed to compare the initial and
final weights by sexes, and weight gains by sexes, respectively. Results: The rats from both
sexes increased their body weight, demonstrating that the extract caused no
negative effect. There were significant differences in weight gains between the
males and females; no macroscopic lesions or pathological alterations
associated with the administration of the product were observed. Conclusions: The
aqueous extract of legumes, reshoots, and leaves of adult D. cinerea plants administered to rats orally was not
toxic at the limit oral dose in rats.
Keywords: limit dose, legume, plant,
reshoots (Source: BVS)
INTRODUCCIÓN
Durante las últimas cuatro décadas se
han desarrollado moléculas sintéticas antiparasitarias de gran eficacia, amplio
espectro y bajo efecto residual (Dorta-Contreras,
2007). Sin embargo, en la actualidad el tratamiento de enfermedades
parasitarias se ha complicado debido a la resistencia a fármacos comerciales
por lo que es necesario utilizar alternativas para el control de estos
patógenos resistentes o multirresistentes, una de las
cuales puede ser el uso de metabolitos secundarios de plantas con actividad
antibacteriana y/o sobre nematodos gastrointestinales (Satyajit
y Lutfun, 2012; Epe y Kaminsky, 2013; Medina et
al., 2014; Hernández-Alvarado et al.,
2018).
Existen numerosas investigaciones que
han abordado el estudio del potencial nutracéutico de
diversas plantas, entre ellas D. cinerea, cuyo uso aún no se ha extendido en Cuba.
Particularmente se señala su efectividad en el control de nematodos
gastrointestinales (Arece et al.,
2012) por lo que resulta válido asumir que el uso de la biomasa comestible de
esta planta podría ser una alternativa eficaz para el control de parasitosis en
pequeños rumiantes.
Los estudios toxicológicos y
farmacológicos de corte experimental constituyen un paso de la ruta crítica por
la que necesita transitar un nuevo producto, nutracéutico
u otros, para su establecimiento sobre bases científicamente sustentadas que
aporten los criterios de seguridad, consumo y disposición del producto en
estudio (Repetto y Repetto,
2012). El uso de preparados obtenidos de D. cinerea
requieren de la necesidad de caracterizar su seguridad toxicológica.
El objetivo del estudio fue evaluar
la toxicidad a dosis límite de tres extractos de legumbres, rebrote y hojas de
planta adulta de D. cinerea
en ratas.
MATERIALES
Y MÉTODOS
El estudio se realizó en el
Laboratorio de Toxicología del Departamento Biológico del Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central “Marta Abreu”
de Las Villas.
Identificación
de las sustancias de ensayo y del vehículo
Nombre de los productos:
Extracto acuoso de legumbres de D. cinerea (L.)
Extracto acuoso de rebrotes de D. cinerea (L.)
Extracto acuoso de hojas de plantas
adultas de D. cinerea
(L.)
Obtención: Extracto acuoso mediante
maceración al 20% de biomasa vegetal consistente en legumbres, hojas de la
planta adulta y de sus rebrotes colectadas en una misma área y época del año.
El material vegetal se obtuvo de las legumbres, hojas de la planta adulta y de
sus rebrotes de D. cinerea
establecidas en áreas pertenecientes a la Cooperativa de Créditos y Servicios
“El Vaquerito”, ubicadas en la carretera a Camajuaní
km 2.5, Santa Clara, provincia de Villa Clara, Cuba.
Características organolépticas:
·
Color: Pardo verdoso oscuro
·
Apariencia: Líquido fluido.
·
pH: 6.6
Sistema de
ensayo
Se utilizaron Ratas jóvenes de la
especie Rattus norvegicus Berkenhout 1769 (variedad albina), de la línea o cepa Sprague Dawley (Cenp:SD), de ambos sexos, con un peso entre 150 g y 200 g,
consanguíneas y heteroxénicas. El peso se verificó
con una balanza técnica digital, marca Sartorius,
ubicada en el mismo local de tenencia y alojamiento de los animales. Las
hembras fueron nulíparas y no gestantes. La variación de peso de los animales
utilizados en el ensayo no excedió de ± 20% de la media del peso para cada
sexo.
Los animales fueron asignados
aleatoriamente al grupo experimental. Al finalizar el estudio los animales
fueron sacrificados mediante el método eutanásico de concusión. Se evitó todo
sufrimiento innecesario y se tuvo en consideración principios y procedimientos
bioéticos.
Las condiciones de mantenimiento y
alimentación, alojamiento y adaptación, el procedimiento de identificación y la
limpieza y desinfección se realizaron teniendo en cuenta los procedimientos que
aseguraran el bienestar de los animales. El agua de beber suministrada fue agua
potable previamente esterilizada por autoclaveo. El
acceso al agua y los alimentos fue ad
libitum durante todo el estudio.
Las condiciones ambientales fueron:
Temperatura 22oC ± 3oC, Humedad relativa: 50% a 70%,
Ciclos luz-oscuridad: 12 / 12 horas e Intensidad luminosa: 200 lux a 250 lux.
Dichas variables climáticas se mantuvieron mediante aires acondicionados, extractor
de aire, sistema automatizado de apagado y encendido de luz fluorescente
debidamente programado.
Distribución y
formación de grupos experimentales
De los animales que fueron declarados
como aptos para el estudio, se asignaron aleatoriamente a cada grupo
experimental diez ratas necesarias. A cada grupo experimental se le asignaron
cinco ratas de cada sexo. Los animales de igual sexo permanecieron en cajas de
policarbonato tipo T-3 con cama de bagazo y bajo las mismas condiciones de
tenencia durante todo el ensayo. Dichas cajas se identificaron en la tapa de
rejilla metálica correspondiente.
El diseño y conformación de los
grupos experimentales se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Grupos experimentales.
|
Grupos
|
n y sexo
|
Dosis
|
|
Extracto hojas de planta adulta
|
5 hembras
|
2000 mg / kg masa corporal
|
|
5 machos
|
|
Extracto rebrotes
|
5 hembras
|
|
5 machos
|
|
Extracto legumbres
|
5 hembras
|
|
5 machos
|
Vía de
administración, dosis, frecuencia y duración
Vía de administración: los animales
se administraron por vía oral mediante una cánula rígida de acero con un
engrosamiento en la punta para evitar perforaciones esofágicas en los animales
al momento de la administración. Los animales estuvieron en ayuna durante la
noche anterior al inicio del ensayo. Posteriormente en la mañana se pesaron y
se les administró la sustancia de ensayo acorde al peso corporal. Se continuó
el ayuno por tres a cuatro horas posteriores, tras las cuales se repuso el
alimento. El agua de bebida nunca se retiró de las cajas de los animales en ensayo.
Dosificación: Se administró el
producto a una dosis límite establecida internacionalmente para productos en
estudio cuya composición o datos experimentales previos hagan suponer que esta
provocará ninguna o muy poca toxicidad. El volumen de extracto que se
administró correspondió a una dosis de 2000 mg / kg de masa corporal.
Observaciones
clínicas
Los animales administrados se
observaron a simple vista durante las primeras 3-4 horas después de la
administración, donde se observó la ocurrencia de mortalidad o la aparición de
síntomas o signos de toxicidad. Posteriormente se realizaron observaciones uno
o dos veces por día, por 14 días.
Al finalizar el período de
observación de 14 días, a los animales se les practicó el sacrificio por el
método de concusión de eutanásico de concusión y se les realizó análisis
macroscópico patológico.
Peso corporal
Se pesaron los animales al inicio del
estudio y cada 7 días post-administración con una balanza técnica digital,
marca Sartorius. Las variaciones de peso se calcularon
y registraron cuando la supervivencia fue superior a 1 día. También se evaluó
la ganancia de peso corporal hasta que terminara el período de observación post
administración.
Estudio anatomopatológico
Se practicó necropsia y análisis
patológico macroscópico a los animales al final del estudio en busca de
lesiones y alteraciones macroscópicas.
Consideraciones
éticas
El estudio consideró los principios
de reducción del número de animales al no tener que emplear animales controles
y utilizar el mínimo número de ratas para este tipo de estudio. El personal que
ejecutó el estudio fue calificado en el uso de mamíferos de laboratorio y tuvo
en cuenta los procedimientos que disminuyen el stress, el distress
y el deterioro del estado higiénico sanitario, de modo tal que se garantizó
durante el estudio el bienestar de los animales mediante el mantenimiento de
las condiciones de tenencia para la especie, la no-variabilidad en las
respuestas y la validez y confiabilidad de los datos que se generaron.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis no paramétrico mediante el estadistico U de Mann Whitney para comparar el incremento
de los pesos por sexo al inicio y al finalizar el estudio y una prueba de pares
de Wilcoxon para comparar los pesos del inicio con
los del final por sexo. El nivel de significación estadística fue de p ≤
0,05. Los estudios fueron realizados mediante el paquete estadístico
STATISTICA, versión 10.
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Se utilizaron en el ensayo 15 ratas
de cada sexo, clínicamente sanas y aptas para este tipo de estudio las cuales no
presentaron mortalidad ni ningún síntoma clínico que se asociara con la
administración del extracto acuoso de legumbre, rebrote y hojas de plantas
adultas de D. cinerea
en los animales de ambos sexos.
El peso de
los animales durante el estudio se comportó de manera creciente y lógica, de
acuerdo con el tiempo de duración del experimento.
La tabla 2
muestra que los animales en los que les fue administrado el extracto acuoso de
legumbres,
rebrote y hojas de planta adulta por vía oral; el peso promedio inicial, el
peso promedio final y el incremento de peso vivo fueron mayores en las ratas
del sexo macho.
Tabla 2.
Comportamiento del peso promedio (±DE) en ratas del estudio de toxicidad oral de los
extractos acuosos de legumbres, rebrote y de la hoja de planta adulta D. cinerea
|
Tratamientos
|
n
|
Sexo
|
Peso inicial (g)
|
Peso final (g)
|
Incremento de peso (g)
|
|
Legumbres
|
5
|
Machos
|
199,6 ± 13,97
|
235,8 ± 9,23
|
135 ± 8,15
|
|
5
|
Hembras
|
180,2 ± 3,42
|
234,6 ± 17,31
|
55,6 ± 8,50
|
|
Rebrote
|
5
|
Machos
|
199,8 ± 5,89
|
329,6 ± 12,34
|
129,8 ± 7,82
|
|
5
|
Hembras
|
176,4 ± 8,82
|
239,6 ± 9,50
|
63,2 ± 10,25
|
|
Hojas de Planta
adulta
|
5
|
Machos
|
204,8 ± 6,94
|
311,2 ± 11,45
|
106,4 ± 11,08
|
|
5
|
Hembras
|
202,4 ± 8,56
|
250,6 ± 12,81
|
48,2 ± 6,30
|
El análisis estadístico de la
evolución de la masa corporal de las ratas administradas con cada extracto
demostró la existencia de diferencias estadísticas significativas para un nivel
de significación de p ≤ 0,05,
al comparar los pesos iniciales y finales por sexos. Para ambos sexos siempre
el peso fue significativamente superior al finalizar el estudio lo que
demuestra un incremento positivo de este indicador de salud en las tres
evaluaciones (Gráfico 1).
|
Extracto de legumbres
|
|
a) Comportamiento en hembras (Wilcoxon
Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
b) Comportamiento en machos. (Wilcoxon Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
|
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image004.png)
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image006.png)
|
Extracto de hojas de planta adulta
|
|
c) Comportamiento en hembras (Wilcoxon
Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
d) Comportamiento en machos. (Wilcoxon Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
|
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image008.png)
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image010.png)
|
Extracto de rebrotes
|
|
e) Comportamiento en hembras (Wilcoxon Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
f) Comportamiento en machos. (Wilcoxon
Matched Pairs Test, p = 0,043)
|
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image012.png)
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image014.png)
Gráfico 1. Análisis del comportamiento del peso
corporal de ratas administradas con extractos de D. cinerea. Comparación del
peso por sexo al inicio y al final del estudio.
En cuanto al análisis realizado a la comparación del
incremento de peso corporal por sexos en los tres extractos, se demostró que
existieron diferencias significativas para
un nivel de significación de p
≤ 0,05,
a favor de las ratas machos sobre las del sexo hembras (Gráfico 2).
a) Extracto de legumbres b)
Extracto de hojas de planta adulta
c) Extracto de rebrotes
Gráfico
2. Análisis del incremento del peso corporal de ratas administradas con
extractos de de D. cinerea.
Comparación entre sexos (Mann-Whitney U Test, p = 0,012).
De manera
general las ratas de los diferentes
sexos incrementaron su masa corporal de manera significativa al finalizar el
estudio con respecto al inicio, comportamiento normal para el período de
desarrollo somático en que se encontraban y que demuestra la no influencia
negativa por la administración de los extractos en estudio.
Hubo
diferencias significativas para el incremento de peso entre hembras y machos,
comportamiento normal para esta especie y línea de rata. Dicho comportamiento
del peso, correlacionado con la edad de los individuos y con diferencias entre
sexos, fue verificado al comparar los pesos con los reportados por el Centro de
Recursos Animales (Animal Resources Centre) en el Departamento de Información de
Referencias de Roedores (Rodent Reference Information), para
animales de la misma línea y edad de ratas (Animals Resources Centre, 2021).
En las
necropsias realizadas a la totalidad de los animales que se sacrificaron al
finalizar el período de exposición, no se observaron lesiones macroscópicas
indicativas de alteraciones patológicas ni atribuibles a la administración del
producto.
Varios investigadores
refieren efectos terapéuticos en
el uso de D. cinerea como medicina alternativa (cicatrizante, emético, antinflamatorio, y vermífugo entre otros), a través
de diferentes formas y partes
de la planta (Borges
et al., 2020).
El amplio uso de diferentes formas de
preparación obtenidas de diferentes partes de la planta D. cinerea
complementa la ausencia de toxicidad demostrable al administrar dosis límites
del extracto acuoso, por lo cual se declara como seguro para el uso
previsto.
CONCLUSIONES
El extracto acuoso de legumbres, rebrote y hojas
de la planta D. cinerea, no resulta tóxico a dosis límite oral en ratas.
REFERENCIAS
Animals Resources Centre. (2021).
Rodent Reference Information. Rat and Mice Weights. http://www.arc.com/Animal
Resources Centre/Rodent Reference Information/Rat and Mice Weights.htm
Arece, J., Roche, Y., López, Y., & Molina, M. (2012). Efecto
in vitro del extracto acuoso de Dichrostachys cinerea (L.)
Wight & Arn. en el desarrollo de las fases
exógenas de estrongílidos gastrointestinales de
ovinos. Pastos y Forrajes, 35(3),
301-310. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S086403942012000300006&lng=es&tlng=es
Borges Espinosa, A. Y., Reinoso Pérez, M., Espinosa Ruiz, R., & Avello
Oliver, E. (2020). Actividad antihelmíntica “in vitro” de extractos acuosos
obtenidos a partir de la biomasa comestible de Dichrostachys cinerea (L.) Wight et Arn. Revista de Producción Animal, 32(2),
92-102. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S222479202020000200092&Ing=es&tIng=es
Dorta Contreras, A. J. (2007). Aporte de
Cuba al estudio de Angiostrongylus cantonensis. Acimed, 16(4),
0-0. http://bvs.sld.cu/revistas/aci/vol16_4_07/aci0710-07.htm
Epe, C., & Kaminsky,
R. (2013). New advancement in anthelmintic drugs in veterinary medicine. TRENDS in Parasitology, 29(3):129-134. https://www.researchgate.net/publication/235396471_New_advancement_in_anthelmintic_drugs_in_veterinary_medicine
Hernández-Alvarado, J., Zaragoza-Bastida, A., López-Rodríguez, G., Peláez-Acero, A.,
Olmedo-Juárez, A., & Rivero-Perez, N. (2018). Actividad antibacteriana y sobre
nematodos gastrointestinales de metabolitos secundarios vegetales: enfoque en
Medicina Veterinaria. Abanico veterinario, 8(1), 14-27. https://doi.org/10.21929/abavet2018.81.1
Medina, P., Guevara, F., La O, M., Ojeda, N., & Reyes, E.
(2014). Resistencia antihelmíntica en ovinos: una revisión de informes del
sureste de México y alternativas disponibles para el control de nemátodos gastrointestinales. Pastos y Forrajes, 37(3), 257-263. https://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S086403942014000300001&Ing=es&tIng=es
Repetto,
J.M., & Repetto, K.G. (2012). Toxicología
fundamental. Cuarta Edición. Ediciones Díaz de Santo. 43 Pp. https://www.academia.edu/32600500/Toxicologia_Fundamental_Repetto_4a_Edici%C3%B3n
Satyajit,
D.S., &Lutfun, N. (2012). An Introduction to
Natural Products Isolation. En: Satyajit DS, Lutfun N. (eds.). Natural Products Isolation, Methods in
Molecular Biology (3ra ed.). UK: Humana Press Inc., 864, 2-3. https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-61779-624-1_1
Contribución
de los autores
Concepción y diseño de la
investigación: AYBE, OMC, MSW, AMD, LLP, MRP; análisis e interpretación de
los datos: AYBE, OMC, MSW, AMD, LLP, MRP; redacción del artículo: AYBE, OMC,
MSW, AMD, LLP, MRP.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image002.png){kind=small}
, Osmany Marrero Chang **%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image017.png)
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image018.png)
%202022.%20Evaluación%20de%20la%20toxicidad%20por%20dosis%20única%20oral%20de%20extractos%20de%20Dichrostachys%20cinerea%20en%20ratas._archivos/image020.png)