RESUMEN
Antecedentes: La antisepsia final del pezón es una medida
preventiva para la mastitis, con este propósito se utilizan soluciones acuosas
de Propolina®. Este trabajo tuvo como
objetivo determinar la actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones
de Propolina® frente a microorganismos causantes de
mastitis. Materiales y métodos: Se
aislaron microorganismos de muestras de leche de vacas con tres cruces de
mastitis. Se determinó la actividad antimicrobiana de soluciones acuosas de Propolina® entre 2,5 y 60,0 mg.ml-1 frente a las
bacterias aisladas y a una cepa Gram negativa de Escherichia coli ATCC 25922 mediante el método de
difusión en agar por pocillos. Se utilizó un ANOVA simple para
determinar el efecto de las dosis de Propolina® sobre las especies bacterianas y la Prueba de Rangos
Múltiples de Duncan para la comparación entre las dosis. Resultados:
Se identificaron las
bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp.,
que resultaron sensibles a las soluciones de Propolina®.
La cepa Gram negativa de Escherichia coli ATCC
25922 no mostró sensibilidad. Las concentraciones 60, 30 y 20 mg.ml-1 resultaron
más efectivas frente a Staphylococcus aureus y Staphylococcus sp. Coagulasa negativo. Conclusiones: Se aislaron e identificaron diferentes géneros
microbianos causantes de mastitis subclínica que incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus
sp. Coagulasa negativo
y Corynebacterium sp. Las soluciones
de Propolina® mostraron una mayor
efectividad frente a los microorganismos Gram positivos Staphylococcus aureus y Staphylococcus sp. Coagulasa negativo los cuales resultaron sensibles a las
concentraciones 20, 30 y 60 mg·ml-1 y 30 y 60 mg·ml-1 de Propolina®, respectivamente.
Palabras clave: actividad antimicrobiana, propóleo, Staphylococcus sp. (Fuente:
BVS)
ABSTRACT
Background: The final antisepsis of nipples is performed
with aqueous solutions containing Propolina® to
prevent mastitis. The aim of this paper was to determine the antimicrobial
activity of different concentrations of Propolina®
against mastitis-causing microorganisms. Materials and Methods The
microorganisms were isolated from the milk of cows having three mastitis
crossings. The antimicrobial activity of aqueous Propolina®
solutions between 2.5 and 60.0 mg.ml-1 was tested against isolated
bacteria and Gram-negative Escherichia coli strain ATCC 25922 by
spraying the solution in plate wells containing agar. A one-way ANOVA was used
to determine the effect of the propoline dose on the
bacterial species associated with mastitis; the Duncan’s multiple rank-sum test
was used for dose comparisons. Results: The Gram-positive
bacteria were identified: Staphylococcus aureus, coagulase-negative Staphylococcus
sp. and Corynebacterium sp., which
were sensitive to the Propolina® solutions, while
Gram negative Escherichia coli strain ATCC 25922 showed no sensitivity.
The 60, 30, and 20 mg.ml-1 concentrations were more effective
against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus
spp. Conclusions: Staphylococcus aureus, coagulase-negative Staphylococcus
sp., and Corynebacterium sp. were
isolated and identified, as causing subclinical mastitis. The Propolina® solutions were highly effective
against Gram positive bacteria Staphylococcus aureus and
coagulase-negative Staphylococcus sp., which were sensitive to the 20,
30, and 60 mg.ml-1, and 30 and 60 mg.ml-1 concentrations
of Propolina®, respectively.
Keywords: antimicrobial activity, propoleum, Staphylococcus spp. (Source:
BVS)
INTRODUCCIÓN
La mastitis es una inflamación de la
glándula mamaria que causa pérdidas económicas significativas en los rebaños
bovinos (Ramírez et al.,
2018). Se clasifica de acuerdo a su curso en clínica y subclínica. En la forma
clínica se observan los signos de la enfermedad y cambios en la composición
química de la leche. La forma subclínica es más común que la clínica, pero en
este caso no se aprecian síntomas en los animales ni cambios en la apariencia de
este producto (Benić et al., 2018).
Esta enfermedad se considera un
problema importante de salud pública que provoca disminución de la cantidad y
calidad de la leche producida (Andrade et al., 2017; Quevedo, 2018). Puede modificar su composición
proteica y lipídica (Valdivia et al., 2020), favorecer la excreción de microorganismos a la leche
y afectar la inocuidad de este alimento (Romero et al., 2018).
La mastitis bovina frecuentemente
tiene un origen infeccioso y puede ser causada por cerca de 150 especies
microbianas (Benić et al., 2018). Su prevención debe contemplar la higiene del
ambiente donde se desarrollan los animales y del ordeño. La correcta
desinfección del pezón post-ordeño o sellado, es una de las medidas más
importantes para evitar su presentación. Consiste en la aplicación de una
solución antiséptica a los pezones, después de retiradas las pezoneras. Esta
práctica tiene el propósito de reducir la penetración y la multiplicación de
patógenos infecciosos y ambientales que quedan en la piel y la punta del pezón
al finalizar el ordeño, para evitar su entrada y multiplicación en el canal del
pezón (Blanco y Montero, 2018). Con este objetivo, en la Empresa Pecuaria
Genética de Matanzas (EPGM) se emplea la solución acuosa de tintura de Propolina®, elaborada a base de propóleos.
El propóleo
es uno de los productos de la colmena que genera gran interés en la comunidad
científica. Posee una compleja composición y un amplio espectro de actividades.
Su acción antimicrobiana está descrita frente a cepas bacterianas Gram positivas
y Gram negativas (Przybyłek et al., 2019). Sin embargo, su efectividad depende de la especie
microbiana en cuestión, que a su vez puede variar en el tiempo por diversos
factores ambientales, así como por la concentración del producto. Los
resultados indican que la Propolina®
constituye una alternativa recomendable para la prevención de la mastitis. El
empleo de soluciones de propóleo para combatir
microorganismos permite contar con productos naturales e inocuos para el
enfrentamiento a microorganismos resistentes a los antibióticos (Fernández-León
et al., 2022). A partir de estos
resultados, esta investigación tuvo como objetivo determinar la actividad
antimicrobiana de diferentes concentraciones de Propolina®
frente a microorganismos causantes de mastitis subclínica.
MATERIALES
Y MÉTODOS
Toma de
muestras de leche
El muestreo se realizó en una
vaquería perteneciente a la EPGM, en el mes de mayo de 2019. En la unidad, el
ordeño se realiza dos veces al día (4:00 am y 4:00 pm) con el empleo de un
equipo mecanizado marca Eurolate. Las vacas
corresponden a la raza Mambí y se alimentaban con pasto estrella [Cynodon nlemfuensis
(Van-deryst)], forraje King grass
CT-115 (Cenchrus purpureus Schumach Morrone), caña molida (Saccharum officinarum),
pienso de vaca lechera y sales minerales ad
libitum.
Se tomaron diez muestras de leche de vacas que
no presentaban signos clínicos de mastitis ni alteraciones en la leche. Las
muestras se obtuvieron por ordeño manual de cuartos que previamente se
diagnosticaron como positivos a tres cruces de mastitis subclínica, mediante la
prueba de California Mastitis Test (CMT). Para ello, las ubres se lavaron con
agua corriente y posteriormente se desinfectaron con un algodón estéril
humedecido en etanol al 70%. Se colectaron aproximadamente 5 ml de leche que se
extrajeron después de realizar el despunte. Las muestras se conservaron en
hielo y se trasladaron al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Agronomía de la Universidad de Matanzas para su procesamiento.
Aislamiento de
bacterias causantes de mastitis
Se sembraron 100 µl de cada muestra
de leche en placas que contenían medio agar nutriente mediante diseminación con
espátula de Drigalsky. Las placas se incubaron
durante 24 h a 37 °C en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se
seleccionaron las colonias que mostraron características culturales diferentes,
las que se purificaron mediante siembra por estrías en placas con agar
nutriente con el empleo de un asa de siembra de platino. Para
la conservación de las cepas aisladas se utilizaron dos métodos: en cuñas de
agar nutriente a 4
°C y en glicerol a -20 °C.
Pruebas
bioquímicas e identificación de bacterias causantes de mastitis
Las cepas conservadas se inocularon
en tubos que contenían 3 ml de caldo nutriente y se incubaron a 37 °C por 24
horas. Luego se sembraron en tubos con cuñas de agar nutriente y se colocaron
en las condiciones descritas anteriormente. Las pruebas bioquímicas catalasa,
manitol salado, hidrólisis del almidón y coagulasa se
realizaron según el procedimiento descrito por MacFaddin
(2006).
Se realizó la tinción de Gram a
partir de los cultivos jóvenes de las cepas que se sembraron en agar nutriente
por el método de Madigan et al. (2015). Se determinó la presencia de endospora
por el mismo procedimiento.
Evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana
de diferentes concentraciones de Propolina®
Para los estudios de actividad
antimicrobiana se utilizó la Propolina® procedente
de la Empresa Productora y Comercializadora de Productos Biofarmaceúticos
de Matanzas GENIX®, LABIOFAM que contenía 60 mg·ml-1 de sustancias bioactivas. Se prepararon diluciones acuosas de este
producto con las concentraciones siguientes: 2,5; 5,0; 7,5; 20,0 y 30,0 mg·ml-1.
La evaluación de la actividad
antimicrobiana de las cinco diluciones preparadas y la Propolina®
en su forma de presentación (60,0 mg·ml-1) se efectuó en placas
mediante el método de difusión en agar por pocillos (Pérez et al., 2020). Se utilizó como control una solución hidroalcohólica al 10%. La evaluación se realizó frente a
los microorganismos aislados de las muestras de leche procedentes de vacas
diagnosticadas con mastitis subclínica y a una cepa Gram negativa de Escherichia coli ATCC
25922.
Los microorganismos que se emplearon
en este ensayo crecieron a 37°C durante 24h en medio agar Müeller-Hinton.
Posteriormente, se tomaron colonias aisladas que se inocularon en tubos que contenían
9 ml de caldo Müeller-Hinton y se dejaron crecer
hasta que alcanzaron una concentración equivalente al tubo 0,5 de la escala de
Mc Farland. Luego se sembraron por diseminación en
placas que contenían agar Müeller-Hinton con el
empleo de un hisopo estéril. Los pocillos se realizaron con un horadador
estéril y se le añadieron 200 µl de cada solución a evaluar. Las placas se
colocaron a 4 °C durante 15 minutos y después se incubaron a 37 °C durante 18h
(Pérez, 1990). Se realizaron tres réplicas por cada cepa.
La inhibición del crecimiento se
calculó mediante la fórmula: I = DZI – DP
Dónde: DZI es el diámetro de la zona
de inhibición y DP el diámetro del pocillo, ambas mediciones se realizaron con
un pie de rey.
Para realizar la evaluación
cualitativa de la inhibición se empleó la escala de Duraffourd
(Duraffourd et al., 1987) que establece los criterios siguientes:
·
Nula (-) cuando el
diámetro del halo de inhibición es inferior a 8 mm.
·
Sensibilidad límite
(sensible = +) cuando el halo de inhibición comprende entre 8 y 14 mm.
·
Medio (muy sensible =
++): para un diámetro entre 14-20 mm.
·
Sumamente sensible (+++)
para un diámetro superior a 20mm.
Análisis
estadístico
Los datos se procesaron con el
programa estadístico Statgraphics Plus 5.0 sobre
Windows. Se analizó primeramente el ajuste de los datos a una distribución
normal y la homogeneidad de varianza mediante la prueba de bondad de ajuste
(Chi cuadrado) y la prueba de Bartlett, respectivamente. Se realizó un Análisis
de Varianza de clasificación simple y la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan
(P˂0,05) para la comparación entre las medias.
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Aislamiento de
bacterias causantes de mastitis
Se aislaron 15 cepas bacterianas Gram
positivas de las muestras de leche tomadas de vacas previamente diagnosticadas
con tres cruces de mastitis subclínica. Se seleccionaron tres de ellas, de
acuerdo a las características morfológicas de sus colonias y a la respuesta a
la tinción de Gram para su identificación. Como resultado se aislaron los
microorganismos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp.
Staphylococcus aureus es uno de los principales
patógenos relacionados con la presencia de mastitis subclínica de tipo
contagioso en los rebaños (Jurado-Gámez et al., 2019). Este
microorganismo y Enterobacter spp. se
identificaron como agentes causantes de esta enfermedad en una lechería de la
Empresa Pecuaria Genética Los Naranjos, en el municipio Caimito provincia
Artemisa, Cuba (García-Sánchez et al., 2018). Su aislamiento en la leche
implica el riesgo de la presencia de enterotoxinas en
este y otros productos lácteos que pueden causar gastroenteritis e infecciones
en la piel en los humanos (Benić et al.,
2018; NiolaToasa et al., 2020).
Las cepas de Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp. aisladas
en el presente trabajo también son descritas como causantes de infecciones
leves o de tipo subclínico (Sánchez Bonilla et
al., 2018). Estos autores consideran a Staphylococcus sp.Coagulasa negativo como un
patógeno emergente en mastitis a nivel mundial.
Corynebacterium spp. se encuentra entre los
patógenos contagiosos y ambientales causantes de mastitis (Andrade et al.,
2017; Hahne et al., 2018). Su presencia en un
rebaño puede indicar la desinfección inadecuada de los pezones (Callejo,
2010). Este género bacteriano también se diagnosticó en casos de la enfermedad
en cabras por Nabih et al. (2018).
Los tres microorganismos aislados en
la presente investigación se clasifican como Gram positivos. Sin embargo, en la
literatura consultada se plantea que esta enfermedad también pude ser causada
por microorganismos Gram negativos. Entre estos Escherichia coli constituye uno de los aislamientos
más frecuentes (Fiordalisi et al., 2016; Andrade et al.,2017).
Evaluación de
la actividad antimicrobiana in vitro
de diferentes concentraciones de Propolina®
frente a bacterias Gram positivas y negativas
Teniendo en cuenta los resultados
obtenidos en el experimento anterior se determinó la actividad antimicrobiana in vitro de concentraciones de Propolina® entre 2,5 –60,0 mg·ml-1 frente
a las cepas salvajes aisladas de vacas con mastitis subclínica y a la cepa de E.
coli ATCC 25922 y los datos se procesaron
estadísticamente. A partir del análisis estadístico se aceptó la normalidad de
los datos ya que se obtuvo un p-valor igual a 0,0808. De manera similar, se
aceptó la homogeneidad de la varianza de los datos (hipótesis nula), ya que el
p-valor calculado fue de 0,163.
En la Tabla 1 se muestran los
resultados estadísticos del Análisis de Varianza Simple realizado a cada grupo
microbiano. Como se puede observar, el p-valor
calculado para cada grupo microbiano fue menor que 0,05, por lo cual se
obtuvieron diferencias significativas entre las distintas dosis evaluadas para
cada microorganismo en estudio.
Tabla 1. Resultados estadísticos del
Análisis de Varianza Simple realizado a cada grupo microbiano estudiado.
|
Grupo microbiano
|
N
|
gl
|
Cuadrado medio
|
F
|
Sig.
|
|
Staphylococcus aureus
|
21
|
6
|
66,08
|
173,46
|
0,0000
|
|
Staphylococcus spp. Coagulasa negativo
|
21
|
6
|
110,38
|
193,17
|
0,0000
|
|
Corynebacterium sp.
|
21
|
6
|
40,60
|
1107,36
|
0,0000
|
La tabla 2 muestra los resultados del
efecto antibacteriano de las concentraciones de Propolina®
estudiadas frente a las cepas salvajes de Staphylococcus
sp. Coagulasa
negativo y a Staphylococcus aureus. En el
caso de la primera cepa, la mayor inhibición se alcanzó con la concentración de
60,0 mg·ml-1, seguida por las concentraciones de 30,0, 20,0 y 7,5
mg·ml-1 respectivamente; mientras que las dosis de 5,0 y 2,5 mg·ml-1,
no evidenciaron actividad inhibitoria con valores similares estadísticamente a
la solución hidroalcohólica utilizada como control.
La Propolina®
también fue efectiva frente a la cepa aislada de S. aureus. Todas las concentraciones evaluadas
evidenciaron un efecto antibacteriano al comparar los resultados con la
disolución hidroalcohólica control. Los valores de
inhibición más altos se observaron con la concentración 60,0 mg·ml-1,
seguida de 30,0 y 20,0 mg·ml-1, respectivamente. Las concentraciones
entre 7,5 y 2,5 mg.ml-1 mostraron valores similares entre sí,
inferiores a 20,0 mg.ml-1 del producto, pero superiores al control.
Según la escala de Duraffourd la cepa de S.
aureus aislada fue sensible a las concentraciones
de Propolina® superiores a 7,5 mg·ml-1
y muy sensible a la dosis máxima evaluada de 60 mg·ml-1 y la cepa de
Staphylococcus spp Coagulasa
negativo resultó sensible a la concentración 30 mg·ml-1 y muy
sensible a 60 mg·ml-1.
Tabla 2.
Actividad antibacteriana de diferentes concentraciones de Propolina®
frente a Staphylococcusaureus, Staphylococcusspp. Coagulasa
negativa y a Corynebacteriumsp.
|
Propolina®
(mg·ml-1)
|
Staphylococcus aureus
|
Staphylococcus spp Coagulasa negativo
|
Corynebacterium sp.
|
|
I
(mm)
|
±
EE
|
S
|
I
(mm)
|
±
EE
|
S
|
I
(mm)
|
±
EE
|
S
|
|
2,5
mg·ml-1
|
6,33d
|
0,33
|
-
|
0,00f
|
0,00
|
-
|
1,9b
|
0,22
|
-
|
|
5
mg·ml-1
|
7,33d
|
0,33
|
-
|
0,66ef
|
0,33
|
-
|
1,7b
|
0,22
|
-
|
|
7,5
mg·ml-1
|
6,66d
|
0,33
|
-
|
3,33d
|
0,33
|
-
|
0,86c
|
0,22
|
-
|
|
20
mg·ml-1
|
8,66c
|
0,33
|
+
|
5,66c
|
0,88
|
-
|
0,86 c
|
0,22
|
-
|
|
30
mg·ml-1
|
11,0b
|
0,00
|
+
|
8,33b
|
0,33
|
+
|
0,86 c
|
0,22
|
-
|
|
60
mg·ml-1
|
15,33ª
|
0,66
|
++
|
17,66a
|
0,33
|
++
|
10,83a
|
0,22
|
+
|
|
Alcohol
(10%) Control
|
0,00e
|
0,00
|
-
|
1,66e
|
0,33
|
-
|
0,83c
|
0,22
|
-
|
I: diámetro de la zona de inhibición. Los datos representan medias de
tres réplicas. Letras diferentes indican diferencia significativa según Duncan
(P≤0,05). La sensibilidad (S) se indica según la escala de Duraffourd (-): nula, (+): sensible, (++): muy sensible. ± EE: error estándar.
Los
resultados obtenidos concuerdan con los referidos por otros autores donde se
observó un efecto antibacteriano del propóleo frente
a Staphylococcus spp. Fiordalisi et al. (2016)
estudiaron el efecto antibacteriano de diferentes concentraciones de propóleo frente a S.aureus. Estos
investigadores observaron una reducción del crecimiento bacteriano en
concentraciones entre 750-1,000 μg·ml-1, lo cual se relacionó
con diversos componentes presentes en el propóleo,
principalmente flavonoides, ésteres y compuestos terpenoides.
Navarro López et al. (2018), también vinculan la
acción antibacteriana del propóleo a la presencia de
flavonoides, ésteres, sesquiterpenos, ácidos grasos,
hidroxiácidos, además de otros compuestos como la acacetina
y la galangina que establecen un sinergismo
significativo para favorecer la actividad biológica.
Estudios
similares de actividad antimicrobiana in
vitro con un propóleo chileno frente a la cepa Staphylococcus aureus (ATCC
33862) evidenció una sensibilidad a concentraciones superiores a 1 mg.ml-1
(Balboa et al., 2018). En trabajos
realizados por Rodríguez
et al. (2020), se evaluó
la efectividad de propóleos de diferentes regiones de México frente a esta
especie bacteriana. Estos autores determinaron valores de Concentración Mínima
Inhibitoria entre 0,19 y 15,0 mg·ml-1 y de Concentración Mínima
Bactericida entre 0,37 y 30,0 mg·ml-1. Suran et al.
(2015) obtuvieron valores de concentración mínima inhibitoria frente a Staphylococcus aureus entre
16 y 64 mg·ml-1, con el uso de soluciones no alcohólicas de propóleo.
Un
estudio sobre el efecto de extractos etanólicos de propóleo frente a aislamientos de Staphylococcus spp. procedentes de cabras con mastitis,
demostró la efectividad de estos extractos con una eficacia de 72,67% (Santos et al., 2020). En la presente
investigación, se comprobó que la cepa Staphylococcus aureus
fue sensible a concentraciones de 20, 30 y 60 mg·ml-1de
Propolina®, mientras que la cepa Staphylococcus sp. Coagulasa
negativo mostró sensibilidad ante 30 y 60 mg·ml-1 del
producto.
En la tabla 2 se muestra además el
efecto de la Propolina®
frente a Corynebacterium sp. Como se
puede observar, frente a este microorganismo solo se obtuvo un efecto inhibitorio
en la máxima concentración evaluada (60 mg.ml-1). En el caso de la
cepa Escherichia coli ATCC
25922 se consideró
resistente ya que no mostró sensibilidad a ninguna de las dosis estudiadas.
La actividad antibacteriana observada
en la presente investigación con el uso de la Propolina®,
concuerda con los resultados obtenidos por otros investigadores. Klhar et al. (2019)
enfrentaron un extracto etanólico de propóleo con una concentración de 300 mg·ml-1 a
bacterias Gram positivas y Gram negativas y comprobaron que los niveles más
altos de inhibición se alcanzaron frente a las Gram positivas.
Los resultados obtenidos en el
enfrentamiento de las disoluciones de propolina ante Corynebacterium sp. pueden
estar relacionados con las características estructurales de la pared celular,
la cual tiene una arquitectura compleja debido a que estas bacterias están
cubiertas por una capa de peptidoglicano a la que se
une covalentemente una de arabinogalactanos. Unido a
esto se encuentra una capa de ácidos micólicos, la
cual es funcionalmente equivalente a la capa LPS de las bacterias Gram
negativas. Adicionalmente, se encuentra una capa más externa compuesta de
polisacáridos, glicolípidos y proteínas (Burkovski,
2013).Se ha descrito que uno de
los mecanismos de resistencia intrínseca por los cuales las bacterias se hacen
menos susceptibles a los desinfectantes es la formación de biopelículas,
característica presente en este género (Rozman et al.,
2021; Souza et al., 2020).
Fiordalisi et al., (2016)
también estudiaron las propiedades antimicrobianas de propóleos brasileños de
diferentes orígenes geográficos frente a cepas de Staphylococcus
aureus y
E. coli. En el caso de este último
microorganismo, encontraron una eficacia limitada que se asoció con la
complejidad química que poseen las paredes celulares de las bacterias Gram
negativas. Resultados similares se encontraron al evaluar extractos etanólicos de propóleos mexicanos frente a estos dos
microorganismos (Rodríguez et al., 2020). Estos autores lograron inhibir
el crecimiento de Staphylococcus aureus, pero no se apreció efectividad frente a Escherichia coli.
CONCLUSIONES
Se aislaron e identificaron diferentes
géneros microbianos causantes de mastitis subclínica que incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp. Las
soluciones de Propolina® mostraron una
mayor efectividad frente a los microorganismos Gram positivos Staphylococcus aureus y Staphylococcus sp. Coagulasa negativo los cuales resultaron sensibles a las
concentraciones 20, 30 y 60 mg·ml-1 y 30 y 60 mg·ml-1
de Propolina®, respectivamente.
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Contribución
de los autores
Concepción y diseño de la
investigación: ALVA, YRF, MM.MM, MGP, YPH, MMMT; análisis e interpretación de
los datos: ALVA, YRF, MM.MM, MGP, YPH, MMMT; redacción del artículo: ALVA, YRF,
MM.MM, MGP, YPH, MMMT.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Yasmary Rubio Fontanills *