Abstract
Aim. The present study
aimed to select Lactobacillus spp.
strains with probiotic properties from the digestive tract of Melipona beecheii.
Materials and methods: The probiotic
properties of each of the strains were determined in vitro from the following tests: growth capacity, organic acid
production, antimicrobial activity against Paenibacillus larvae, antimicrobial susceptibility, hydrophobicity and osmotic
resistance to syrup. Results:
Thirteen strains with distinctive characteristics of the Lactobacillus genus were isolated. In the growth capacity study,
the best strains with cell concentration ≥ 9 Log CFU. mL-1
were L6, L34, L42, L31, and L32. Regarding organic acid production, strain L13
stood out compared to the control. All strains had antimicrobial activity
against the pathogen P. larvae, where
L31 formed the largest halos with 43,33 mm. The antimicrobial susceptibility of
the strains to 13 antibiotics showed a pattern of resistance to kanamycin and
sensitivity to the remaining antibiotics. The hydrophobicity test with xylene
and toluene as organic solvents showed that all strains except L34 presented
high classification. The strains' osmotic resistance to syrup was evaluated and
growth was only observed at a concentration of 1000 μg/L, where L31 was superior in terms of viability. Conclusions: The strain with the
greatest probiotic potential in vitro
was L31.
Keywords: stingless bees,
microbiota, probiotics (Source: AGROVOC)
INTRODUCCIÓN
Las abejas
son imprescindibles para el ciclo de vida en la tierra, pues son los
principales agentes polinizadores de los cultivos comerciales y la flora
silvestre de todo el mundo. Esta actividad asegura la biodiversidad, la salud
de los ecosistemas y contribuye a la producción de alimentos en los sistemas
agrícolas (Arredondo et al., 2018;
Kim et al., 2024). De ellas también
se puede obtener la miel y otros productos apícolas que se emplean en la
industria alimentaria, cosmética y la medicina tradicional (El-Didamony et al.,
2024).
Actualmente, las abejas se enfrentan a numerosos desafíos como el
cambio climático, la destrucción de sus hábitats, la exposición a pesticidas,
presencia de especies invasoras además de la afectación por numerosos agentes
patógenos que pueden deteriorar su salud y supervivencia. Las
enfermedades más frecuentes detectadas en las colmenas son la varoosis, la Loque americana, la nosemosis,
e infecciones provocadas por diferentes virus ARN, entre otras (Arredondo et al., 2018; Daisley
et al., 2020).
La
aplicación de antibióticos y acaricidas sintéticos para contrarrestar o
minimizar estas enfermedades es una práctica limitada en muchos países, debido
a las desventajas que poseen. Se conoce que estos tratamientos pueden causar un
desbalance en la homeostasis entérica de estos insectos, lo que afecta su
metabolismo y la respuesta inmune. Además, se estimula la aparición de genes de
resistencia en microorganismos patógenos y la presencia de residuos de estas
sustancias en los productos apícolas, lo cual constituye una amenaza para la
salud humana (Hernández-García et al.,
2021).
Ante esta
problemática, las investigaciones se centran en encontrar soluciones
innovadoras para mejorar la salud de las abejas como la aplicación de
probióticos, microorganismos vivos que al ser suministrados en cantidades
adecuadas confieren beneficios para la salud del huésped. Estos aditivos
zootécnicos pueden inhibir el desarrollo de microorganismos patógenos, constituyen la primera barrera del sistema inmune, mejoran la digestibilidad de los nutrientes y el rendimiento productivo de los animales (Milián et al., 2023).
Las abejas
sin aguijón (Apidae: Meliponini)
se conocen en Cuba como "abejas de la tierra". La especie Melipona beecheii B.
constituye el ganado meliponícola del país (Lóriga et al.,
2015), y a diferencia de Apis mellifera, es más resistente a las infecciones debido a
la combinación de varios factores entre los que destaca su estilo de vida y la
presencia de una microbiota intestinal estable compuesta principalmente por
bacterias de las familias Lactobacillaceae, Bifidobacteriaceae, Acetobacteraceae
y Streptococcaceae. Estos simbiontes son
adquiridos del ambiente fundamentalmente y tienen funciones específicas dentro
del hospedero (Cerqueira et al., 2024).
Esta especie representa un reservorio inexplorado de
microorganismos con potencial biotecnológico, debido a la poca información
existente sobre la microbiota de su tracto digestivo. De ahí que esta
investigación tuvo como objetivo, seleccionar in vitro cepas de Lactobacillus spp.
con propiedades probióticas a partir del tracto digestivo de M. beecheii,
como alternativa para el tratamiento y la prevención de enfermedades en A. mellifera.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de Lactobacillus
spp. del tracto digestivo de M. beecheii
Las
muestras fueron tomadas en 5 apiarios
de la Empresa Apícola de Matanzas y se colectaron en cada uno entre 10-20
abejas adultas vivas, provenientes de colmenas sanas. Para el aislamiento de
las bacterias se siguió el protocolo descrito por Cerqueira et al. (2024). Las abejas de cada uno de los lotes fueron previamente desinfectadas
(solución clorada al 1%) y lavadas tres veces con solución salina peptonada estéril para eliminar contaminantes externos.
Luego se extrajeron asépticamente los intestinos de las abejas y se
homogenizaron en 1 mL de disolución salina tamponada
con fosfato (PBS) estéril. Se realizaron 8 diluciones seriadas y las tres
últimas se sembraron por triplicado en placas con agar Man-Rogosa-Sharpe
(MRS, Merck, Alemania) para el crecimiento de Lactobacillus spp. Luego se incubaron a
37ºC durante 48 h en condiciones de microaerofilia
(adición de doble capa de agar). Posteriormente, se seleccionaron aquellas
colonias con morfología diferente. Una vez obtenidos los cultivos puros de cada
aislamiento, se conservaron en agar tioglicolato
suplementado con carbonato de calcio (0,1 g por tubo) y se mantuvieron en
refrigeración a 4ºC.
Los aislamientos se clasificaron de acuerdo a características
culturales, la morfología, tinción de Gram y la realización de pruebas
bioquímicas (catalasa y oxidasa). Se seleccionaron para el estudio las que
cumplían con las características presuntivas del género Lactobacillus (Mathialagan et al., 2018).
Determinación del potencial
probiótico in vitro de los aislados
Capacidad de crecimiento y producción
de ácidos orgánicos
El ensayo
se realizó a partir de cultivos frescos
de los diferentes aislamientos a 37ºC durante 24 h en caldo MRS. Se prepararon
diluciones a partir de este medio hasta obtener una turbidez equivalente al
estándar 0,5 de la escala McFarland (DO600 = 0,132; 1,5 x108
UFC.mL-1) y se inocularon a razón de 1:10 (v/v) en frascos con 50 mL del mismo medio. Luego se incubaron a 37ºC durante 24 h
en condiciones estáticas. Se tomaron muestras a las 0 y 24 h para realizar posteriormente
el conteo de viables a través del método de diluciones seriadas. Las placas con agar MRS se incubaron a 37ºC por 48 h
en condiciones de microaerofilia (Harrigan
y McCance, 1966). Se tomó como criterio de selección
aquellas cepas que lograron un crecimiento ≥ 9 Log UFC. mL-1.
La producción de ácidos orgánicos se determinó por una titulación
ácido-base del sobrenadante de cada cultivo a las 24 h según el método AOAC
947.05. Se emplearon como reactivos el NaOH 1M y la fenolftaleína como
indicador. La concentración de ácidos orgánicos equivalente está dada por el
consumo de NaOH 1M en mL, lo que equivale a 90,08 mg
de ácido láctico. Se utilizó como control la cepa de Lactobacillus salivarius C65 y los
resultados se expresaron en g.L-1 (AOAC, 2023). Cada ensayo se
realizó por triplicado para cada aislamiento. Se seleccionaron las mejores
cepas productoras de ácidos orgánicos.
Actividad
antimicrobiana frente a Paenibacillus larvae
En este ensayo, se empleó el método de difusión de sustancias en agar propuesto
por Schillinger y Lucke (1989). Como cepa indicadora
se utilizó P. larvae
(cultivada en caldo J) procedente del Laboratorio de Referencia para
Investigaciones y Salud Apícola de Sancti Spiritus,
Cuba (LARISA), la cual se enfrentó a los metabolitos producidos por cada uno de
los aislados en estudio en caldo MRS. Se tomó como criterio de selección
aquellos aislados que provocaron los mayores halos de inhibición.
Los resultados de estos tres ensayos, se utilizaron como criterios
preliminares para seleccionar las mejores cepas que continuaron a estudios
posteriores.
Hidrofobicidad
Se determinó la hidrofobicidad superficial de las cepas de Lactobacillus ssp.
mediante la medición de la afinidad por el disolvente orgánico que presentan
las células cultivadas en un sistema de dos fases (agua-disolvente orgánico),
como medida predictiva de su capacidad de adhesión a epitelios. Este ensayo se
realizó según las indicaciones reportadas por Montegudo-Mera
et al. (2019). Se utilizaron como
solventes orgánicos el xileno y el tolueno. El porcentaje de hidrofobicidad se
calculó a través de la siguiente ecuación: H % = [(A0 – A)
/A0] * 100, donde A0 y A son la absorbancia
antes y después de la exposición con los solventes orgánicos. La actividad de hidrofobicidad de las cepas evaluadas
se clasificó como baja (0-29 %), media (30-50%) y alta (51-100%). Se tomó como
criterio de selección aquellas cepas candidatas a probióticos que alcanzaron
una clasificación alta.
Susceptibilidad antimicrobiana
Para este ensayo, se utilizó el método de difusión en
discos (Hudzicki, 2009) frente a 13 antibióticos. Se empleó el agar
MRS como medio de cultivo a 37ºC en condiciones de anaerobiosis, debido a las
exigencias nutricionales y fisiológicas de los lactobacilos. Los discos utilizados fueron: ampicillin (AMP) (10 µg), ampicillin/sulbactan (AMS) (20 µg), bacitricina (BACIT) (40U), ceftiofur
(CFT) (30 µg), cloranfenicol (CLOR) (60 µg), doxiciclina (DXT) (30 µg),
eritromicina (E) (15 µg), cefepine (FEP) (30 µg),
kanamicina (K) (30 µg), oxacillin (OX) (1 µg),
penicilina G (P) (10 IU), piperacillin (PRL) (100
µg), y tetraciclina (TE). A las 48 h de
incubación, se midieron los halos de inhibición. Cada análisis se realizó por
triplicado. Se tomó como criterio de
selección las cepas que mostraron sensibilidad a la mayoría de los antibióticos
probados.
Resistencia osmótica al jarabe
Se prepararon suspensiones de los aislamientos obtenidos en PBS, a
partir de cultivos en caldo MRS a 37ºC durante 24 h. La turbidez de las
suspensiones se igualó con el estándar 4 de la escala Mc Farland
(DO600 = 0,669; 109 UFC.mL-1). Paralelamente,
se preparó un jarabe en concentraciones de 1000 o 2000 g de azúcar por litro de
agua (1:1 y 2:1 respectivamente), utilizado habitualmente por los apicultores
en el campo. A partir de las suspensiones originales en PBS, se realizaron dos
suspensiones bacterianas en jarabe 1:1 y 2:1 a una concentración final de 1x105
UFC.mL-1 y se incubaron a 37ºC durante 72 h. El número de células
bacterianas viables en cada tratamiento se determinó por recuento en placa en
agar MRS a las 0 y 72 h. Las placas se incubaron a 37ºC durante 48 h en
condiciones de microaerofilia (Arredondo, 2015). Se
tomó como criterio de selección definitivo para este estudio aquellas
candidatas a probióticos que mantuvieron la viabilidad después de las 72 h.
Análisis estadístico
El análisis de los datos se realizó con el programa estadístico Statgraphics Centurion 19.1.1 sobre
Windows. Se determinó el ajuste de
los datos a una distribución normal mediante la prueba de Shapiro-Wilk W y la
homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Levene modificado
para todos los ensayos excepto para la hidrofobicidad. En ese caso se empleó el ajuste de bondad de
Anderson-Darling para verificar que la muestra proviene de una distribución
normal. Se realizó un análisis de varianza simple para determinar la presencia
de diferencias significativas entre las cepas con respecto a los criterios de
selección evaluados. Para el contraste de las medias se realizó la prueba de
rangos múltiples de Tukey HSD con p<0,01. Los datos se muestran como la media ± de la
desviación estándar.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
De un total
de 65 aislados obtenidos a partir del tracto digestivo de M. beecheii,
13 de ellos cumplieron con las características distintivas del género Lactobacillus
(Mathialagan et
al., 2018): colonias con bordes elevados
de coloración blanquecina a cremosa de superficie gruesa y brillante.
Al microscopio se observaron bacilos Gram positivos que reaccionaron
negativamente a las pruebas de catalasa y oxidasa.
Este artículo constituye el primer reporte en Cuba sobre el aislamiento
de microorganismos con propiedades probióticas a partir del tracto digestivo de
M. beecheii B.
Estos
resultados concuerdan con estudios recientes realizados por Cerqueira
et al. (2024), quienes afirman la
presencia del género Lactobacillus en
el tracto digestivo de tres especies de Melipona presentes en Brasil. Otras investigaciones también
demuestran que este género es predominante en la microbiota intestinal de estos
insectos (Mathialagan et al., 2018; Fernández-Roblero et al., 2020; Mohammad et al., 2020).
A partir de
los análisis estadísticos realizados se aceptó la normalidad y la homogeneidad
de la varianza de los datos (hipótesis nula), ya que el p-valor fue superior a
0,01.
En la Tabla 1, se aprecian los resultados de la
capacidad de crecimiento y producción de ácidos orgánicos de las cepas en
estudio a las 24 h en caldo MRS. En el primer ensayo, nueve cepas se destacan
por presentar valores de concentración celular superiores a 9 Log UFC. mL-1
de las cuales L6, L34, L42, L31 y L32 obtuvieron los mejores resultados
sin diferencias significativas entre ellas (p<0,01).
Una propiedad que debe caracterizar a los probióticos
es la alta tasa de crecimiento, ya que los mismos deben aplicarse en cantidades
suficientes para llegar al tracto gastrointestinal, resistir los impedimentos
químicos que se presentan y ser capaces de establecerse para lograr una buena
colonización de la mucosa y el contenido intestinal (Sosa et al., 2018).
En relación
a la producción de ácidos orgánicos,
se verifica la capacidad que tienen todos los aislados de excretar estas
sustancias con efecto antimicrobiano. La cepa L13 alcanzó el mayor valor con
respecto al control con 16,93 g.L-1. El menor valor observado fue
para L32 con 9,58 g. L-1.
Tabla 1. Criterios de selección preliminares para la determinación del
potencial probiótico in vitro de las
cepas de Lactobacillus spp.
|
Cepas
|
Capacidad de crecimiento
(Log UFC. mL-1)
|
Producción de ácidos orgánicos
( g.L-1)
|
Diámetros de inhibición frente a P.
larvae (mm)
|
|
L6
|
10,26 ± 0,24a *
|
13,55 ± 0,03g
|
42,67 ± 2,52a *
|
|
L30
|
8,97 ± 0,07e
|
16,75 ± 0,04c
|
31,67 ± 2,89bcd
|
|
L24
|
9,74 ± 0,12bc *
|
15,40 ± 0,05d
|
40,67 ± 2,52ab *
|
|
L31
|
10,01± 0,02abc *
|
12,07 ± 0,03i
|
43,33 ± 2,89a *
|
|
L34
|
10,26 ± 0,24a *
|
11,76 ± 0,04j
|
35,0 ± 5,00abcd *
|
|
L42
|
10,20 ± 0,17ab *
|
14,25 ± 0,04f
|
39,0 ± 2,64abc *
|
|
L32
|
10,01 ± 0,17abc *
|
9,58 ± 0,03l
|
30,33 ± 0,58bcd
|
|
L131
|
9,54 ± 0,09cd *
|
14,38 ± 0,03e
|
28,33 ± 2,89cde
|
|
L13
|
9,14 ± 0,11de *
|
16,93 ± 0,02b*
|
38,33 ± 2,89abc*
|
|
L36
|
8,95 ± 0,05e
|
9,65 ± 0,02l
|
33,67 ± 1,53abcd *
|
|
L10
|
9,01 ± 0,02e *
|
12,97 ± 0,03h
|
24,33 ± 5,13de
|
|
L19
|
8,46 ± 0,15f
|
14,47 ± 0,02e
|
18,33 ± 2,89e
|
|
L35
|
8,10 ± 0,17f
|
10,27 ± 0,02k
|
30,67 ± 2,52bcd
|
|
C65(Control)
|
-
|
21,62 ± 0,02a
|
-
|
Letras diferentes en una misma columna indican
diferencias significativas según prueba de rangos múltiples de Tukey HSD
(p<0,01). Las cepas marcadas con (*) se consideran las de mejor desempeño en
cada ensayo.
Los lactobacilos que se seleccionen como probióticos deben producir
elevadas concentraciones de ácidos orgánicos, pues esta es una condición
necesaria para la eliminación de patógenos en el tracto gastrointestinal. La
disminución del pH que se produce en esta cavidad acelera las reacciones
bioquímicas de la digestión (Rodríguez et al., 2021).
Todas las
cepas tuvieron actividad antimicrobiana frente al P. larvae.
Los valores más elevados correspondieron a L31 con 43,33 mm, sin embargo,
esta cepa no mostró diferencias significativas con los diámetros de inhibición
detectados para L6, L24, L42, L13, L34 y L36 (Tabla 1).
Estos
resultados son superiores a los detectados por Rodríguez et al. (2021),
quienes utilizaron el mismo método para la realización de este ensayo. En su
estudio, se midieron halos de 14,83 mm y 12 mm para Lactobacillus kunkeei SS70 y L.
rhamnosus SS73 respectivamente, aisladas del
tracto digestivo de A. mellifera.
Daisley et al. (2020) evaluaron un consorcio
comercial de lactobacilos llamado BioPatty compuesto
por L. plantarum
Lp39, L. rhamnosus
GR-1 y L.
kunkeei BR-1 tanto en colmenas como en
larvas infectadas a nivel de laboratorio con P. larvae. Los resultados obtenidos
expresan una reducción de la infección en ambos casos.
Arredondo et
al. (2018) estudiaron la acción benéfica de una mezcla de cuatro cepas de L.
kunkeei en larvas y abejas adultas. Su
administración en modelos controlados de laboratorio disminuyó la mortalidad
asociada a la infección por P. larvae en las
larvas y los recuentos de esporas de N. ceranae
de abejas melíferas adultas. Estos resultados sugieren que la mezcla probiótica
puede ser una estrategia atractiva para mejorar la salud de las abejas.
La
actividad antimicrobiana del género Lactobacillus
se asocia con diversos factores entre los que se destacan la producción de
metabolitos como el ácido láctico,
bacteriocinas o el peróxido de hidrógeno que actúan en la membrana plasmática
de otros microorganismos. Estas sustancias son un criterio a
tener en cuenta en el momento de elegir una cepa probiótica, por su capacidad
de controlar patógenos en el tracto gastrointestinal.
A partir de
la coincidencia en los criterios de selección empleados en estos tres ensayos y
su correspondiente análisis estadístico, se seleccionaron las mejores cepas
candidatas a probióticos que continuaron a la próxima etapa de investigación:
L13, L31, L6, L34, L42 y L24.
La
hidrofobicidad celular es una estimación indirecta de la adhesión y
colonización exitosa de los probióticos a las células epiteliales del
intestino. Las bacterias al tener esta propiedad, pueden aumentar sus posibilidades
de supervivencia en el tracto gastrointestinal y ejercer efectos positivos en
la salud del huésped (Shehata et al., 2024).
En la Tabla
2, se aprecian los resultados de esta prueba para las cepas evaluadas. Se
comprobó que todas presentan clasificación alta frente al xileno y el tolueno,
excepto la cepa L34 que alcanzó una clasificación media para el último solvente
orgánico mencionado.
Los datos
obtenidos en esta investigación en cuanto al xileno son superiores a los
detectados por Meradji et al. (2023), quien analizó esta propiedad para una cepa de L. kimbladii/ kullabergensis procedente de A. mellifera intermissa.
Los valores medidos fueron de 83.40%. Otros investigadores también reportan
resultados inferiores en cuanto a este solvente (Mohammad et al., 2020).
Shehata et al. (2024), utilizaron el xileno y el
tolueno en BAL. Los datos máximos alcanzados correspondieron a la cepa de L. plantarum
HBMSS3 con 65,33% para el xileno y 56,36% para el tolueno. Estos resultados son
inferiores a los observados en este ensayo para el primer solvente, sin
embargo, en el caso del segundo fueron superiores a los obtenidos para L34 y
L42.
Tabla
2. Hidrofobicidad de Lactobacillus spp. con xileno y tolueno como solventes orgánicos.
|
Cepas
|
Xileno
|
Tolueno
|
|
L6
|
99,86 ± 0,02a*
|
99,14 ± 0,03b*
|
|
L13
|
99,47 ± 0,03ab*
|
99,06 ± 0,03b*
|
|
L24
|
98,26 ± 0,1b*
|
99,85 ± 0,03a*
|
|
L31
|
95,30 ± 0,29c*
|
98,07 ± 0,09c*
|
|
L34
|
67,82 ± 0,23d*
|
34,79 ± 0,03e
|
|
L42
|
99,36 ± 0,06ab*
|
55,30 ± 0,08d*
|
Letras
distintas indican diferencias significativas entre las cepas según Prueba de
rangos múltiples de Tukey HSD (p<0,01). Las cepas marcadas con (*) se
consideran las de mejor desempeño en cada ensayo. Clasificación: Alta
(51-100%), Media (30-50%) y Baja (0-29%).
Aunque la
capacidad de adhesión de las bacterias probióticas no garantiza necesariamente
un beneficio para la salud, su unión al epitelio intestinal puede tener un
papel protector contra las bacterias dañinas a través de la competencia por los
sitios de unión de la célula huésped (Monteagudo-Mera et al., 2019). Se
comprobó que las cepas L6, L13, L24, L31 y L42 tienen una alta hidrofobicidad,
por lo que se deduce que estas tienen mayores posibilidades de adherirse a la
mucosa intestinal.
Los microorganismos probióticos se utilizan para mejorar la salud
intestinal y el sistema inmunológico, por lo que un criterio a tener en cuenta
en su selección es conocer si existe la posibilidad de transmisión de genes de
resistencia a antibióticos hacia bacterias patógenas en el intestino. Este
fenómeno, constituye un problema de salud a nivel mundial, por lo que se
prefiere que estos candidatos sean sensibles a los antimicrobianos prescritos
comúnmente en baja concentración o que la resistencia que exhiban sea inherente
al microorganismo (Fernández-Roblero et al., 2020).
En la Tabla 3, se muestran los resultados obtenidos para este ensayo. Se
observa sensibilidad en todos los antibióticos probados excepto para la
kanamicina donde L24, L31, L34 y L42 son resistentes.
Se ha
descrito que las bacterias lácticas presentan resistencia a la amikacina, oxacillina y vancomicina y se considera para el género Lactobacillus
como resistencia intrínseca. En el caso de la kanamicina, esta conducta se debe
a la falta de un sistema de transporte activo eficiente para los
aminoglucósidos en la membrana celular (Mohammad et al., 2020).
Elzeini et al. (2021), realizaron esta prueba
para las especies de L. brevis HBE2 y L. casei HBE5, entre otras bacterias, aisladas del tracto
digestivo de A. mellifera.
En este caso, las cepas fueron resistentes a la ampicilina, la vancomicina
y la kanamicina, resultado que concuerda con este estudio solo para el último
antibiótico. Existe similitud en cuanto a sensibilidad para el cloranfenicol.
Según Goh et
al. (2021), se observó un patrón de resistencia a la mayoría de
antibióticos probados, cuando se estudiaron bacterias
aisladas de tres especies de abejas sin aguijón en Sabah. Sin embargo, la
especie L. pentosus
mostró sensibilidad a ampicillina y cloranfenicol
datos análogos a los encontrados en el presente trabajo.
Tabla 3. Susceptibilidad antimicrobiana de
las cepas de Lactobacillus spp.
|
Antibióticos
|
L6
|
L13
|
L24
|
L31
|
L34
|
L42
|
|
AMP
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
AMS
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
BACIT
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
CFT
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
CLOR
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
DXT
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
E
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
FEP
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
K
|
S
|
S
|
R
|
R
|
R
|
R
|
|
OX
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
P
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
PRL
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
|
TE
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S
|
S: Susceptible, R: Resistente.
A. mellifera consume altas concentraciones de azúcares a través
del néctar y la miel que adquiere en su dieta. En Cuba en los meses de agosto a
septiembre (correspondiente al período de hambruna), los apicultores les
suministran a las abejas un jarabe con azúcar de caña para su sostenimiento, en
concentraciones de 1000 g/L. Por ambos motivos es importante que los
microrganismos a emplear en el diseño de productos en base a probióticos para
abejas, tengan la capacidad de sobrevivir en estas condiciones, pues ellos son
introducidos en el alimento.
En la Tabla 4, se evidencian los resultados de la supervivencia en el
jarabe. La concentración inicial fue de 5 Log UFC mL-1. Al
transcurrir las 72 horas, los aislados que pudieron resistir a la concentración
1000 g/L fueron: L31, L13 y L34. De ellos, L31 fue la que alcanzó mayor
viabilidad en el orden de 4 Log UFC. mL-1. Para el jarabe cuya concentración fue de
2000g/L no se observó crecimiento en ningún caso.
Este reporte supera al informado por Audisio y
Benitez-Ahrendts (2011) quienes evaluaron la
supervivencia de una cepa de L. johonsonii a concentraciones de azúcar de 125g/L,
250g/L y 500g/L. Estos autores observaron que la cepa no perdía viabilidad a
las 24h al ser incubada en 125 g de azúcar/L, mientras que, en mayores concentraciones
de azúcar no había crecimiento (500 g/L) o se veía muy disminuido (250g/L).
Tabla 4. Resistencia osmótica al
jarabe por Lactobacillus spp.
|
Tiempo (h)
|
Log UFC. mL-1
|
|
L31
|
L34
|
L13
|
|
0
|
5,87± 0,15a
|
5,59± 0,11a
|
5,63± 0,05a
|
|
72
|
4,12± 0,34a*
|
2,77± 0,42b
|
3,27± 0,25b
|
|
Tiempo (h)
|
L6
|
L24
|
L42
|
|
0
|
5,56± 0,07a
|
5,59± 0,11a
|
5,46± 0,15a
|
|
72
|
1,46± 0,15c
|
1,17± 0,29c
|
1,17± 0,29c
|
Letras diferentes en una misma fila indican
diferencias significativas según prueba de rangos múltiples de Tukey HSD (p<0,01).
Las cepas marcadas con (*) se consideran las de mejor desempeño.
Un mejor comportamiento obtuvo Arredondo (2015), quien evaluó la
supervivencia de los aislamientos bajo concentraciones de azúcar similares y
dos valores de temperatura (28ºC y 4ºC). La mayoría fueron capaces de
sobrevivir a las concentraciones y temperaturas utilizadas. Se detectó una
mayor supervivencia de los aislamientos incubados durante 72h a 4ºC. Esto
indicaría que los apicultores podrían preparar el jarabe con el probiótico y
almacenarlo a 4ºC hasta 3 días antes de utilizarlo.
No todas las cepas del género Lactobacillus
muestran la misma capacidad para adaptarse a los ambientes con alta
osmolaridad. La resistencia que manifiesta la cepa L31 pudiera estar asociada a
la acumulación de solutos compatibles (osmoprotectores)
en su citoplasma. Entre ellos encontramos el glicerol, la trehalosa,
glicina betaína, prolina, glutamato, azúcares y
polioles. Estos compuestos retienen agua en la célula, manteniendo el
equilibrio osmótico intracelular, la presión de turgencia, el volumen celular y
la concentración de electrolitos, además de estabilizar la función enzimática (Sionek et al.,
2024).
En medio de la crisis sanitaria apícola actual, el uso de probióticos
tiene gran potencial para mejorar la salud y resistencia a las enfermedades de
estos insectos. Sin embargo, es fundamental ser cauteloso al aplicar
microrganismos que no sean especies nativas. Se deben realizar estudios
exhaustivos para evaluar su eficacia, seguridad e impacto en el ecosistema
antes de usarlos a gran escala.
CONCLUSIONES
El tracto
digestivo de M. beecheii
constituye un reservorio de bacterias del género Lactobacillus con propiedades probióticas in vitro. En este estudio, la cepa L31 fue la que mostró las
mejores potencialidades. Este microorganismo pudiera utilizarse en la
elaboración de un biopreparado probiótico que mejore
la salud y la productividad de A. mellifera.
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Contribución
de los autores
Concepción y diseño de la
investigación: MMMM; análisis e interpretación de los datos: AJRC; redacción
del artículo: APR, ECP.
Conflicto
de intereses
Los
autores declaran que no existe conflicto de intereses.
, Ana Julia Rondón Castillo
*