Abstract
Background: One of
the greatest challenges worldwide is the extinction
of species and breeds for various
reasons, including the loss of
genetic resources. These phenomena result from the
loss of genetic
resources caused by intensive farming practices, selective breeding, harsh climates, and the introduction of non-native species into new habitats. Objective. To genetically characterize the Cuban Creole fighting rooster (Gallus gallus) using the D-loop region
of mitochondrial DNA. Materials and methods:
The study was conducted in private breeding facilities belonging to breeders associated
with the National Enterprise for the Protection of Flora and Fauna in the
western, central, and eastern regions
of Cuba. Fifty-three birds were randomly
selected, and feather samples were taken
for DNA extraction, purification, and amplification. Sequencing was performed by Macrogen
Inc. The resulting sequences were 578 base pairs long. Alignments
were performed using ClustalX 1.83, a UPGMA tree was constructed
with MEGA version 7, and diversity indices were calculated with DnaSP version
6.0. Results: Twenty-two
haplotypes were identified. Haplotype diversity was high
(0.78) and nucleotide diversity
was moderate (0.00443). Tajima's D index was negative and highly significant (-2.354; P < 0.01), revealing
a deviation from neutrality and suggesting an excess of
low-frequency polymorphisms.
Conclusions: The
birds sampled exhibited very high genetic variability.
This research constitutes the first mtDNA genetic
characterization of the Cuban Creole fighting rooster.
Keywords: fowl, haplotypes, mitochondrial, sequencing (Source: AIMS)
INTRODUCCIÓN
Una de las dificultades más grandes
que se presentan a nivel mundial es la extinción de especies y razas por
diferentes razones. Entre las causas más importantes se encuentran las de
carácter natural, como la pérdida de resistencia a enfermedades y la incapacidad
de adaptación a ciertos climas. Estos fenómenos son debidos a la pérdida de
recursos genéticos, provocada por explotaciones intensivas, selección genética,
climas hostiles y la introducción de especies ajenas a nuevos hábitats (Kullan et al., 2026). Además, los costos
de criopreservación de material genético y de
análisis genético son muy elevados, lo que dificulta la preservación del
material genético y la realización de estudios respectivos, como lo menciona la
FAO (2019). Las aves domésticas, productoras de huevo, carne, plumas,
decorativas y de combate, también se ven afectadas por estos elementos,
reduciéndose las razas y disminuyendo la diversidad de genes.
En los últimos años, los científicos
han usado marcadores genéticos con el fin de conocer la estructura genética de
las poblaciones. Las secuencias polimórficas del ADN mitocondrial en la región
D-loop han sido frecuentemente usadas para describir
líneas maternas en animales, mayoritariamente en aves (Hasan et al., 2016; Meydan et al., 2016; Kenchaiwong
et al., 2025). A diferencia de los
microsatélites, la herencia del ADN mitocondrial no se transmite de forma
mendeliana, sino exclusivamente por vía materna, lo que proporciona una gran
ayuda para la construcción de filogenias, además de su elevada tasa de
mutación, la cual ayuda a la identificación del origen y la distribución
poblacional (Abuabara et al.,
2021).
No conocer las características
genéticas de los gallos de combate cubanos implica enfrentar riesgos de pérdida
de genes valiosos con impacto sociocultural y económico. Por tanto, el objetivo
de este trabajo fue caracterizar genéticamente al gallo de lidia criollo cubano
(Gallus gallus)
mediante la región D-loop del ADN mitocondrial.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización y duración
El trabajo se realizó en criaderos
particulares de criadores asociados a la Empresa Nacional para la Protección de
la Flora y la Fauna en las regiones occidental, central y oriental de Cuba;
durante el año 2021.
Animales y muestreo
Se tomaron muestras de plumas con
folículo a 53 aves (Tabla 1). Los animales seleccionados en cada criadero
fueron elegidos al azar. Se extrajeron dos plumas de la región dorsal y dos de
la región ventral de cada ave, las cuales fueron colectadas en bolsas ziploc y transportadas en un termo según lo indicado por Tauros (2019). Las cuales fueron enviadas al laboratorio de
Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
de Cuenca, Ecuador.
Tabla 1. Procedencia y cantidad de aves sometidos a
estudio de ADNmt.
|
Zona
|
Provincia
|
Municipio
|
N
|
|
Occidental
|
Pinar del Río
|
Pinar del Rio
|
2
|
|
Mantua
|
1
|
|
San Luis
|
1
|
|
La Habana
|
Cerro
|
2
|
|
Marianao
|
2
|
|
Guanabacoa
|
1
|
|
Artemisa
|
Guanajay
|
2
|
|
Güira de Melena
|
2
|
|
Artemisa
|
1
|
|
Mayabeque
|
San José
|
1
|
|
Güines
|
2
|
|
Central
|
Las Villas
|
Santa Clara
|
2
|
|
Caibarien
|
1
|
|
Manicaragua
|
1
|
|
Santi Spiritus
|
Santi Spíritus
|
2
|
|
Trinidad
|
1
|
|
Taguasco
|
2
|
|
Ciego de Ávila
|
Ciego de Ávila
|
1
|
|
Morón
|
2
|
|
Majagua
|
1
|
|
Camagüey
|
Camagüey
|
2
|
|
Esmeralda
|
1
|
|
Guáimaro
|
1
|
|
Florida
|
2
|
|
Oriental
|
Granma
|
Bayamo
|
2
|
|
Guisa
|
2
|
|
Buey Arriba
|
1
|
|
Santiago de Cuba
|
Santiago de Cuba
|
1
|
|
El Caney
|
1
|
|
Palma Soriano
|
2
|
|
Holguín
|
Holguín
|
2
|
|
Biran
|
2
|
|
Sagua de Tánamo
|
1
|
|
Guantánamo
|
Guantánamo
|
1
|
Maisí
|
1
|
|
Baracoa
|
1
|
Extracción y purificación del ADN
El ADN mitocondrial se extrajo
siguiendo un protocolo estandarizado que incluyó: fragmentación de folículos,
incubación con etanol al 70%, centrifugación, lisis con Tris-HCl, EDTA, NaCl y
SDS, digestión con proteinasa K y DTT, extracción con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico, precipitación con etanol absoluto, lavado con etanol al 70% y resuspensión en agua grado biología molecular. La
cuantificación se realizó mediante espectrofotómetro.
Amplificación por PCR
La amplificación de la región D-loop se realizó mediante PCR utilizando los
oligonucleótidos OligoL 16750-For y OligoCR16-Rev. La
mezcla de reacción (25 μl) contenía buffer de amplificación 1X, solución enhancer 1X, dNTPs (0,2 mM cada uno), MgSO₄ (2 mM), oligonucleótidos (0.8 μM
cada uno), enzima Pfx ADN polimerasa (0,04 U/μl)
y ADN total (2 ng/μl). El perfil de temperatura incluyó una
desnaturalización inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos de
desnaturalización a 94°C por 45 segundos, alineamiento a temperatura gradiente
y extensión a 68°C por 45 segundos, con una extensión final a 68°C por 5
minutos (Tabla 2 y 3).
Tabla 2. Reactivos para amplificación de ADN.
|
Reactivo
|
Concentración
|
Volumen
|
Concentración
final
|
|
Agua grado biología
molecular
|
No aplica
|
12,9 μl
|
No aplica
|
|
Buffer de amplificación 10X
|
10 X
|
2,5 μl
|
1X
|
|
Solución de enhancer 10X
|
10 X
|
2,25 μl
|
1X
|
|
dNTP´s
|
10 mM c/u
|
0,5 μl
|
0,2mM c/u
|
|
MgSO4
|
50 mM
|
1 μl
|
2 mM
|
|
OligoL 16750-For
|
100 μM
|
0,2 μl
|
0,8 μM
|
|
OligoCR16-Rev
|
100 μM
|
0,2 μl
|
0,8 μM
|
|
Enzima PƒxADN
polimerasa
|
2,5 U/μl
|
0,2 μl
|
0,04 U/μl
|
|
Muestra de ADN total
|
10 ng/μl
|
5μl
|
2 ng/μl
|
|
Volumen
final
|
-
|
25 μl
|
-
|
Tabla 3. Perfil de temperatura de amplificación.
|
Paso
|
Desnaturalización
inicial
|
Número de ciclos:
35
|
Extensión final
|
Almacenamiento
|
|
Desnaturalización
|
Alineamiento
|
Extensión
|
|
Tiempo
(min ´, seg´´ )
|
5´
|
45´´
|
25´´
|
45´´
|
5´
|
|
|
Temperatura (°C)
|
94,0°C
|
94,0°C
|
|
68,0°C
|
68,0°C
|
4,0°C
|
Secuenciación
La secuenciación se realizó por la
empresa Macrogen Inc. (Macrogen,
2019) utilizando el kit BigDyeTerminator versión 3.1
y el analizador de ADN ABI3730XL. Se enviaron 53 muestras y se logró secuenciar
la totalidad de ellas. Las mismas, fueron filtradas y repetidas cuatro veces
(dos en el laboratorio de biología molecular y dos por Macrogen).
Análisis estadísticos
Las secuencias obtenidas fueron de
578 pares de bases. Los archivos en formato "fasta" se editaron con BioEdit (Hall, 1999) y se realizaron alineamientos
múltiples con ClustalX 1.83. Se construyó un árbol
filogenético tradicional mediante el método UPGMA con el software MEGA ver.7.
Los índices de diversidad genética incluyeron: número de sitios segregantes (S), número de haplotipos (h), diversidad haplotípica (Hd), diversidad
nucleotídica (π), número promedio de diferencias nucleotídicas (k) y la
prueba D de Tajima de neutralidad. Los análisis se
realizaron utilizando DnaSP versión 6.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Haplotipos y diversidad genética
Se identificaron 22 haplotipos en las
53 secuencias analizadas (Tabla 4). El haplotipo más frecuente (Hap_2) agrupó a
26 individuos, mientras que 15 individuos presentaron haplotipos únicos. El
número de sitios polimórficos fue de 35, valor superior al reportado en la
mayoría de los estudios consultados (Do et
al., 2019; Yussif y Kugonza, 2023;
Oni et al., 2025). Eltanany
et al. (2016); Meydan
et al. (2016); Zhuang et al. (2023); Kullan
et al. (2026), reportaron entre 12 y
49 sitios polimórficos. No se encontraron deleciones ni inserciones. El número
total de mutaciones fue de 39, de las cuales 27 fueron mutaciones singleton.
Tabla 4.
Haplotipos obtenidos para el gallo de lidia criollo cubano (Gallus gallus domesticus).
|
Haplotipos
|
N
|
Animales
que lo comparten
|
|
Hap_1
|
1
|
[1]
|
|
Hap_2
|
26
|
[2-3, 6-7, 12-14, 20, 22,
27-28, 31, 33-34, 40-41, 43-49, 51, 53]
|
|
Hap_3
|
1
|
[4]
|
|
Hap_4
|
1
|
[5]
|
|
Hap_5
|
2
|
[8, 17]
|
|
Hap_6
|
2
|
[9, 11]
|
|
Hap_7
|
1
|
[10]
|
|
Hap_8
|
1
|
[15]
|
|
Hap_9
|
2
|
[16, 21]
|
|
Hap_10
|
1
|
[18]
|
|
Hap_11
|
1
|
[19]
|
|
Hap_12
|
1
|
[23]
|
|
Hap_13
|
4
|
[24, 26, 32, 42]
|
|
Hap_14
|
1
|
[25]
|
|
Hap_15
|
2
|
[29, 50]
|
|
Hap_16
|
1
|
[30]
|
|
Hap_17
|
1
|
[35]
|
|
Hap_18
|
1
|
[36]
|
|
Hap_19
|
1
|
[37]
|
|
Hap_20
|
1
|
[38]
|
|
Hap_21
|
1
|
[39]
|
|
Hap_22
|
1
|
[52]
|
N: número de
muestras.
La diversidad haplotípica
(Hd) fue de 0,78 (±0,062), valor considerado alto y
superior a 0,7. Este resultado es similar a lo reportado por Zhuang et al. (2023) en Guangxi,
China (0,83) y por Kullan et al. (2026) en cuatro razas nativas de China (0,92), pero
superior a los hallados por Meydan et al. (2016) en Turquía (0,33) y por Eltanany et al.
(2016) en Egipto (entre 0,56 y 0,71). La diversidad nucleotídica (π) fue
de 0,00443, un valor de bajo a moderado, inferior al reportado por Do et al. (2019) en Indonesia (0,0099) pero
superior a los valores de Zhuang et al.
(2023), Meydan et
al. (2016), Eltanany et al. (2016) y Kullan et al. (2026), los cuales no superaron
0,003.
El número promedio de diferencias
nucleotídicas (k) fue de 2,56, valor que duplica al informado por Eltanany et al.
(2016) (1,24) y triplica al hallado por Meydan et al. (2016). El índice D de Tajima fue negativo y altamente significativo (-2,354;
P<0,01), lo que revela una desviación de la neutralidad, probablemente
debida a un exceso de polimorfismos de baja frecuencia y a presión de selección
(Tabla 5). Este resultado contrasta con poblaciones estudiadas por Zhuang et al. (2023), que reportaron valores
positivos de D.
Tabla 5. Índices de diversidad
genética de secuencias estimados para la muestra analizada de gallos de lidia
criollos cubanos.
|
Raza
|
n
|
S
|
h
|
Hd
|
𝜋
|
k
|
D
|
|
Cubana
|
53
|
35
|
22
|
0,78
|
0,00443
|
2,56
|
-2,354
|
|
± DE
|
-
|
-
|
-
|
± 0,062
|
± 0,000001
|
± 0,941
|
P<0,01
|
n: número de
secuencias, S: número de sitios polimórficos, h:
número de haplotipos, Hd: diversidad haplotípica, DE: desviación estándar, 𝜋: diversidad nucleotídica, k: número promedio de
diferencias nucleotídicas y D Tajima´s.
Análisis filogenético
En la figura 1 se observa la
distribución en forma de árbol de los clústeres de los gallos estudiados.
Aunque en el Haplotipo 2 se reunieron 26 individuos, en el Haplotipo 13 se
agruparon cuatro, en los Haplotipos 5, 6, 9 y 15 hubo dos individuos cada uno,
y 15 individuos presentaron su propio haplotipo único. La topología del árbol
UPGMA sugiere una estructura poblacional compleja con múltiples linajes
maternos.
Figura 1. Diagrama de análisis filogenético Neighbor
Joining con el código de las secuencias de gallos
cubanos, ubicados según el CLADO genético al que pertenecen, árbol con raíz. Se utilizaron 1000 repeticiones. MZ699995-MZ700048 secuencias del D-loop del ADNmt de los gallos de lidia criollos cubanos. Como referencia se empleó: AB114069
clado A, AB007744 clado B,
AB003494 clado I, AB114070 clado
C, AY588636 clado D, AF512288 clado
G, AF512285 clado F, D82904 clado
H. El círculo rojo indica las muestras que se ubican en el clado
E y el círculo azul los del clado A.
Los valores de diversidad haplotípica y diversidad nucleotídica encontrados sugieren
una contribución importante de los gallos de lidia criollos cubanos a la
diversidad genética de la especie, similar a lo señalado por Kullan
et al. (2026) para razas chinas. El
alto número de haplotipos (22) para un tamaño de muestra de 53 individuos
indica una variabilidad genética elevada, lo que contrasta con poblaciones más
homogéneas de otros países. Esta alta diversidad podría explicarse por el
origen multiétnico de las poblaciones cubanas (González-Alonso et al., 2025), que han recibido influencias de gallos
traídos desde España, otras regiones de Europa, Asia y África durante el
período colonial. La significativa desviación de la neutralidad (D de Tajima negativo) sugiere que estas poblaciones podrían
haber experimentado expansiones poblacionales recientes o procesos de selección
direccional (Al-Jumaili et al.,
2020).
CONCLUSIONES
Las aves sometidas al muestreo
presentaron una variabilidad genética muy elevada. Esta investigación
constituye la primera caracterización genética a nivel de ADNmt del gallo de
lidia criollo cubano.
REFERENCIAS
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Contribución de
los autores
Concepción
y diseño de la investigación: AVG, GEGV, AAC, AVM, OUR, AAVP; análisis e
interpretación de los datos: AVG, GEGV, AAC, AVM; redacción del artículo: AVG, GEGV, AAC, AVM, OUR,
AAVP.
Conflicto de
intereses
Los
autores declaran que no existe conflicto de intereses.
, Guillermo E Guevara Viera
**