Evaluación de embriones bovinos cultivados en un
dispositivo intravaginal
Evaluation of bovine embryos cultured in
an intravaginal device
Helena Navarro Quevedo *
, Ingrid Avila Pérez *, José Miguel Sánchez Pellitero *, Luis Enrique
Dihigo Cuttis *
*Centro de
Investigaciones para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical, La
Habana, Cuba.
Correspondencia: hnavarroquevedo@gmail.com
Recibido: Febrero, 2025;
Aceptado: Febrero, 2025; Publicado: Marzo, 2025.
INTRODUCCIÓN
La
producción in vitro de embriones (PIVE)
involucra las etapas de maduración, fertilización y cultivo. Esta última
implica el desarrollo de los presuntos cigotos hasta los estadios de mórulas y
blastocitos en condiciones que asemejen a las in vivo. Es común que, durante el cultivo, un porcentaje de las
estructuras obtenidas experimenten un cese o bloqueo del desarrollo embrionario
(Zhang et al., 2023).
Entre
los factores que influyen en el bloqueo embrionario se encuentra el estrés
producido por el ambiente al cual están sometidos los embriones, como son
temperatura, humedad, pH, concentración de gases, entre otros (Hurtado, 2021). Por
tanto, se han recurrido a técnicas que puedan simular el ambiente y los
procesos que ocurren en el tracto reproductivo de la hembra. Una de ellas es el cultivo intravaginal de
embriones mediante la implementación de un dispositivo, que introducido en la
vagina genera las condiciones de temperatura, humedad y concentraciones de
oxígeno y dióxido de carbono necesarias para el desarrollo del embrión (Ranoux,
2012).
Este
sistema fue utilizado inicialmente en humanos y no existen informes
de su aplicación en la PIVE en bovinos hasta el año 2015, donde Pinzón et al. (2015) realizaron una
investigación que demostró la factibilidad del sistema para la producción de
embriones bovinos de 8 y 16 células, con la capacidad de continuar su posterior
desarrollo.
Otro
de los beneficios que ofrece la utilización de este dispositivo es la reducción
de los costos ya que disminuye las tarifas de incubación y monitoreo de
laboratorio durante la etapa del cultivo. Además, a diferencia del cultivo in vivo en oviductos, no necesita de
métodos quirúrgicos ni del sacrificio del animal. Por lo que, el objetivo de
este estudio preliminar fue evaluar la obtención de embriones
bovinos cultivados en un prototipo de dispositivo intravaginal cubano.
DESARROLLO
Se utilizaron hembras vacunas
mestizas-cebú, con una condición corporal (CC) promedio de 2.5 en la escala de
5 puntos para ganado de leche. Los animales se sacrificaron mediante choque
eléctrico y desangrado por yugulación en la loza sanitaria ubicada en Nueva
Paz, provincia de Mayabeque. Se recuperaron los ovarios directamente de cada
animal en un tiempo promedio de 20 minutos posteriores al sacrificio. Se
colectaron 36 ovarios y se colocaron en un litro de solución de transporte
[Solución buffer fosfatada (PBS) + 0,1mg/mL Kanamicina (SIGMA, K1377-25G)] a
36.5-38.5oC para su traslado al laboratorio en un tiempo de 2 horas
posteriores a la colecta.
Los ovarios se procesaron en el
Laboratorio de Biotecnología y Reproducción Asistida del Centro de
Investigaciones para el Mejoramiento Animal en la Ganadería Tropical (CIMAGT).
Se realizaron tres lavados con solución de transporte y se procedió a la
aspiración folicular con bomba de aspiración (Minitube, 23362/0000), con aguja
corta de 18G y una presión que correspondiera a un goteo de 20 gotas por
minuto. Se aspiraron los folículos de un diámetro entre dos y seis milímetros,
y los complejos cúmulo-ovocitos (CCOs) resultantes se depositaron en viales de
50 mL, previamente cargados con cinco mililitros de medio de aspiración [PBS +
1% Suero Fetal Bovino (SFB) (Capricorn, FBS-12B) + 0,1mg/mL Kanamicina (SIGMA,
K1377-25G) + 2,4 x103 mg/mL Heparina (SIGMA, H3149-25KU)] atemperado a 38.5°C.
Los CCOs y el líquido folicular
contenidos en los viales se diluyeron en medio de recolección [TCM199-Hepes
(SIGMA, M-2520) + 0,1mg/mL Kanamicina+ 1%
SFB (Capricorn, FBS-12B) + 0,336 mg/mL NaHCO3 (SIGMA, S5761-500G)]
y se localizaron bajo visión estereoscópica 4x de magnificación (Olympus,
ZS51); en placas de 120 mm (Greiner, 688102). El trabajo se realizó sobre
platinas térmicas (12055/0003) previamente atemperadas a 38.5°C, en cabina de
flujo laminar horizontal (Labconco, 64132). Los CCOS se clasificaron y
separaron según su calidad morfológica siguiendo la metodología descrita por De
Loos et al. (1989) para las
características de la membrana, el citoplasma y el cúmulo apreciables al
estereomicroscopio.
Los CCOs aptos para la maduración (categoría 1 y 2) se lavaron cinco
veces en placas Petri de 35 mm (Nunc, 174943) con medio de recolección. Se distribuyó el mismo número de ovocitos
calidad1 y 2, en dos grupos. El proceso de maduración se realizó en BO-IVM (IVF
Bioscience, 71002), 500 μL de medio en placas de cuatro pozos (Thermo
Scientific, 10404532). Se colocaron en incubadora de CO2 (Nuaire, NU-5100E) a 38,5°C, 5% de CO2 y
en condiciones de máxima humedad (> 90% de humedad relativa) durante 20
horas.
Para la fertilización se empleó pajuelas de semen congelado de un semental Holstein. La separación espermática se realizó con medio comercial BO-SemPrep
(IVF Bioscience, 71003). Posteriormente se evaluó la motilidad y conteo
espermático en cámara Bürker (Marienfeld-Superior, PM-0610230), ambos pasos en
microscopio invertido de contraste de fase (Axiovert, 35M).
Los CCOs maduros se trasladaron a 500 μL de medio BO-IVF (IVF
Bioscience, 71003) cada uno, en placas de cuatro pozos; junto con 2x106
espermatozoides por mililitro. Se colocaron en incubadora de CO2 a
38,5°C, 5% de CO2 y en condiciones de máxima humedad durante 21
horas. Pasado este tiempo, los presuntos cigotos se decumularon utilizando
Vórtex (Heidolph Top-Mix, 94323) durante tres minutos y treinta segundos a 323 g, en viales de 15 mL en dos mililitros de TCM 199. Posteriormente se
lavaron cinco veces en placas Petri de 35 mm, con este mismo medio. Los
presuntos cigotos obtenidos se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos.
El grupo control consistió en 500 μL de medio de cultivo BO-IVC
(IVF Bioscience, 71005) en placa de cuatro pozos, la cual fue colocada en
incubadora de CO2 a 38,5°C, 5% de CO2 y en condiciones de
máxima humedad. El grupo tratamiento consistió en 500 μL de medio de
cultivo BO-IVC (IVF Bioscience, 71005) en un criovial de un mililitro, colocado
dentro de un prototipo de dispositivo intravaginal cubano. Este se colocó en la
vagina de una hembra vacuna no gestante, acoplado a un sistema de sujeción. A
los cinco días, se evaluó el estadio.
Los datos se procesaron y graficaron en el Microsof Excel 2007 y se realizó una prueba de
comparación binomial de proporciones (a=0,05), en el programa Minitab
14 para determinar la existencia
o no de diferencias significativas.
Figura 1: Porcentaje de
cigotos bovinos obtenidos por cultivo in
vitro y mediante la utilización del dispositivo intravaginal INVO-CIMAGT. n=95. Comparación de proporciones (*P<0,05, gl=1).
El animal en el cual se empleó el dispositivo no presentó ninguna
reacción a la aplicación de este. Se recuperó un 77% de las estructuras
depositadas en el criovial debido a la pérdida en el proceso. Mientras que, en
la placa de cuatro pozos se recuperaron todas las estructuras. Valores
inferiores a los obtenidos por Pinzón et al. (2015), quienes obtuvieron
valores superiores de recuperación de un 94%.
En cuanto al porcentaje de cigotos obtenidos, se alcanzó una menor
tasa de división en aquellos cultivados en el dispositivo intravaginal (Fig.1).
Esto puede a que la técnica aún debe perfeccionarse. Esto resultados
difieren con los planteados por Pinzón et al. (2015), quienes alcanzaron tasas
de clivaje semejantes a las que obtuvieron in
vitro.
Estos autores demostraron la obtención de embriones bovinos mediante el cultivo con un
dispositivo intravaginal, sin embargo, detuvieron el experimento a las 72h de
cultivo. Mientras que, el estudio preliminar realizado con un prototipo de dispositivo intravaginal cubano, se llevó el desarrollo de los
embriones hasta estadios de mórula y blastocisto; ya que las estructuras que se
desarrollan hasta estos estadios son las recomendadas internacionalmente para
la crioconservación y posterior transferencia en esta especie.
CONCLUSIONES
En este estudio preliminar, se obtuvieron por primera vez en Cuba
embriones bovinos utilizando esta técnica. Demostrando que es posible alcanzar
un desarrollo embrionario hasta estadios transferibles con un prototipo de
dispositivo intravaginal cubano. Este aún debe perfeccionarse para disminuir la
pérdida de estructuras en el proceso y obtener tasas de clivaje semejantes al
cultivo in vitro.
REFERENCIAS
De Loos, F.,
Van, C., Van, P., & Kruip, T. A. M. (1989). Morphology of immature bovine oocytes. Gamete
Research, 24(2), 197-204. https://doi.org/10.1002/mrd.1120240207
Hurtado, M. V. (2021). Bloqueo
embrionario ¿en qué consiste? España. Recuperado en 29 de enero de 2025 de: www.victoriainvitro.com/bloqueo-embrionario-en-que-consiste
Pinzón, C. A., Acosta, P.,
Cristancho, R., Vélez, C., Pinzón, J., Zambrano, J., Jiménez, C. & Jiménez, C. (2015). Uso de
la vagina como alternativa para la producción de embriones de bovinos. Veterinaria
y Zootecnia, 9(2), 54-64. https://www.researchgate.net/publication/308937560
Ranoux C. In vivo embryo culture device. Z.P. Nagy et al. (eds.), Practical manual of in vitro fertilization: Advanced methods
and novel devices, Springer Science, Luxemburgo. 2012, p.161-169. https://doi.org/10.1007/978-1-4419-1780-5
Zhang, J., Lyu, Q., Li, J., Ma, Z., Yang, R., Yin, X., Yang, L., & Gao,
S. (2023). Dissecting the molecular
features of bovine-arrested eight-cell embryos using single-cell multi-omics
sequencing. Biology of Reproduction, 108(6), 871-886. https://doi.org/10.1093/biolre/ioad038
Concepción
y diseño de la investigación: HNQ, JMSP, IAP, LEDC, análisis e
interpretación de los datos: HNQ, JMSP, IAP, redacción del artículo: HNQ, IAP.
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.