INTRODUCCIÓN
En condiciones naturales y bien
manejadas, el búfalo presenta buenos índices reproductivos y productivos. La
producción in vitro de embriones
(PIVE) se ha utilizado comercialmente para potenciar este resultado, al
maximizar el número de la descendencia de hembras seleccionadas y reducir los
intervalos generacionales. Además, ofrece la posibilidad de fecundar los
ovocitos de hembras prepúberes, gestantes o faenadas
(Kumar et al., 2023).
El número de ovocitos de calidad por
ovario es una importante consideración en la PIVE, no obstante, para su
obtención es necesario escoger una técnica apropiada bajo condiciones
específicas (Kumar et al., 2023).
Dentro de los métodos más utilizadospara la
recuperación de ovocitos de ovarios de búfalas faenadas, se encuentra la
aspiración folicular con jeringuilla y el slicing; destacando el slicing como
método preferencial por la cantidad y calidad de ovocitos obtenidos (Parmar et al.,
2022). A pesar de que el método de aspiración constituye una técnica más rápida
y práctica que permite el procesamiento de un mayor número de ovarios (Pitroda et al.,
2021).
En ninguno de los trabajos reportados
anteriormente se abordó la técnica de punción folicular en ovarios recuperados
de búfalas faenadas, utilizando bomba de vacío,cuyo
beneficio es establecer una presión de aspiración medible y constante durante
todo el proceso. Teniendo en cuenta los planteamientos anteriores se asume que
la utilización de la bomba de vacío debía mejorar la tasa de recuperación de
ovocitos. Por tanto, el objetivo de este trabajo es comparar el efecto de las
técnicas de slicing y punción folicular con bomba de vacío,
en cuanto a cantidad y viabilidad de los ovocitos obtenidos a partir de ovarios
de búfalas (Bubalus bubalis)
faenadas.
DESARROLLO
La colecta de los ovarios se realizó
en la loza sanitaria perteneciente a la Empresa pecuaria-genética Bacuranao, ubicada en la provincia de La Habana. Los
animales, búfalas de río (Bubalus bubalis),
se sacrificaron mediante choque eléctrico y desangrado por yugulación.
Los ovarios fueron recuperados directamente del animal y colocados en 500 mlde solución de salina al 0,9% atemperada a 38.5°C y
fueron trasladados en neveras termostáticas en un tiempo de dos horas
posteriores a la colecta.
Los ovarios fueron procesados en el
Laboratorio de Biotecnología y Reproducción Asistida del Centro de
Investigaciones para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical (CIMAGT).
Se realizaron tres lavados con Solución buffer fosfatada (PBS) + 0,1mg/ml
Kanamicina (SIGMA, K1377-25G) atemperada a 38.5°C. Los ovarios se distribuyeron
aleatoriamente entre los dos tratamientos aplicados, obtención de ovocitos con
bomba de aspiración y obtención de ovocitos por slicing.
La aspiración folicular con bomba de
vacío (Minitube, 23362/0000) se realizó con aguja
corta de 18G y una presión que correspondiera a un goteo de 20 gotas por
minuto. Se aspiraron los folículos de 2 a 6 mm de diámetro, y los complejos
cúmulo-ovocitos (CCOs) resultantes se depositaron en
viales de 50 ml, previamente cargados con cinco mililitros de medio de
recolección de ovocitos [PBS + 1% Suero Fetal Bovino (SFB) (Capricorn,
FBS-12B) + 0,1mg/ml Kanamicina (SIGMA, K1377-25G) + 2,4 x103 mg/ml Heparina
(SIGMA, H3149-25KU)] atemperado a 38.5°C.
Para el desarrollo del método de slicing se tomaron los ovarios con una pinza y
con una cuchilla (bisturí no. 22) se realizaron cortes en toda la superficie
ovárica (folículos de 2 a 6 mm de diámetro). Durante y al finalizar la
operación, el ovario se lavó con medio de recolección de ovocitos (100 ml)
previamente calentado a 38.5°C y se depositaron los CCOs
resultantesy el líquido folicular en un vaso de
precipitado.
Los CCOs y
el líquido folicular contenidos en los viales y el vaso de precipitado se
diluyeron en medio de lavado [TCM199-Hepes (SIGMA, M-2520) + 0,1mg/ml
Kanamicina + 1% SFB (Capricorn, FBS-12B) + 0,336
mg/ml NaHCO3 (SIGMA, S5761-500G)] y se localizaron bajo visión
estereoscópica 4x de magnificación (Olympus, ZS51); en placas de 120 mm
(Greiner, 688102). El trabajo se realizó sobre platinas térmicas (12055/0003)
previamente atemperadas a 38.5°C, en cabina de flujo laminar horizontal (Labconco, 64132). Los CCOS se clasificaron y separaron
según su calidad morfológica para las características de la membrana, el
citoplasma y el cúmulo apreciables al estereomicroscopio, tomando en cuenta las adecuaciones
planteadas por Dubeibe (2021) para búfalos.
Los CCOs se lavaron cinco veces en placas Petri de 35 mm (Nunc,
174943)
con medio de lavado. El proceso de maduración se realizó en 500 μl de
medio BO-IVM (IVF Bioscience, 71002), en placas de
cuatro pozos (Thermo Scientific,
10404532). Se colocaron en incubadora de CO2 (Nuaire,
NU-5100E) a 38,5°C, 5% de CO2 y en condiciones de máxima humedad
(> 90% de humedad relativa) durante 20 horas.
Para la fertilización se
emplearon pajuelas de semen congelado de búfalo. La
separación espermática se realizó con medio comercial BO-SemPrep
(IVF Bioscience, 71003). Posteriormente se evaluó la
motilidad y conteo espermático en cámara de Bürker (Marienfeld-Superior, PM-0610230), ambos pasos se realizaron
en microscopio invertido de contraste de fase (Axiovert,
35M).
Los CCOs maduros se trasladaron a 500 μl de medio BO-IVF
(IVF Bioscience, 71003) cada uno, en placas de cuatro
pozos; junto con 4x106 espermatozoides por mililitro. Se colocaron
en incubadora de CO2 a 38,5°C, 5% de CO2 y en condiciones
de máxima humedad durante 21 horas. Pasado este tiempo, los presuntos cigotos
se decumularon utilizando Vórtex (Heidolph
Top-Mix, 94323) durante tres minutos y treinta
segundos a 323 g, en viales
de 15 ml en dos mililitros de TCM 199. Posteriormente se lavaron cinco veces en
placas Petri de 35 mm, con este mismo medio. Se procedió a llevar los presuntos
cigotos a 500 μl de medio de cultivo BO-IVC (IVF Bioscience,
71005) en placa de cuatro pozos, la cual fue colocada en incubadora a 38,5°C,
5% de CO2 y en condiciones de máxima humedad. A los cinco días, se
evaluó el estadio.
Los datos
se procesaron y graficaron en el Microsoft Excel 2007 y se realizó una prueba de
comparación binomial de proporciones (a=0,05), en el programa Minitab
14 para determinar la existencia o no de diferencias
significativas.
Con la aplicación de los dos
métodos, slicing y aspiración folicular con bomba de
vacío, se obtuvo el mismo número de CCOs. En cuanto a
la viabilidad de estos para la maduración in
vitro, no se encontraron diferencias significativas (Tabla 1). Se observó
al estereoscopio, mayor número de capas de células del cúmulo en aquellos
ovocitos que se obtuvieron mediante la técnica del slicing. Sin embargo, mediante
esta técnica, también se encontróla presencia de CCOs con un cúmulo muy expandido, no aptos para comenzar el
proceso de PIVE. Según las recomendaciones planteadas por Dubeibe
(2021) se consideraron viables aquellos CCOs entre la
categoría I y III, y solo se descartaron aquellos con el cúmulo con poca
compactación, clasificados como categoría IV.
Tabla 1. Clasificación de los CCOs de búfalo
obtenidos por cada técnica. Porcentaje de CCOs
viables para la maduración (categoría I a la III). Comparación de proporciones
(p>0,05, gl=1).
|
CCOs por categoría
|
Método
|
|
Punción con bomba de vacío
|
Slicing
|
|
I
|
0
|
1
|
|
II
|
2
|
4
|
|
III
|
9
|
4
|
|
IV
|
0
|
2
|
|
% viables para la maduración
|
100 % (a)
|
81,8 % (a)
|
En cambio, Parmar
et al. (2022) plantearon la técnica
del slicing como el método más eficaz de obtención
de ovocitos, sin embargo, los autores lo comparan con la aspiración folicular
con jeringuilla y no con bomba de vacío. Siendo este el primer trabajo donde se
reporta esta técnica en ovarios de búfalas recuperados después del sacrificio.
En cuanto al porcentaje de
división (75% para el método con bomba de vacío y 50% con slicing) no se encontraron
diferencias significativas en la aplicación de ninguna de las técnicas (Fig.
1A). Tampoco en cuanto a la tasa de embriones transferibles obtenidos, mórulas
y blastocistos (62,5% para el método con bomba de vacío y 50% con slicing) (Fig.
1B).
Estos valores son superiores
a los reportados por Quintana et al.
(2018), quienes obtuvieron un 38,79% de clivaje y un 17% de embriones
transferibles en nuestro país con el método de aspiración por jeringuilla.
Avalos et al. (2022) reportaron tasas
de clivaje semejantes (63,15%) al utilizar los mismos medios y protocolos que
los aplicados en este trabajo y la técnica de aspiración folicular con
jeringuilla.
A
B
Figura 1: Porcentaje de A: clivaje y B: embriones transferibles, obtenidos
por producción in vitro en búfalo
mediante dos técnicas de recolección de ovocitos, aspiración folicular con
bomba de vacío y slicing.
Comparación de proporciones. (*P>0,05, gl=1).
CONCLUSIONES
Se concluye que puede ser
utilizada la bomba de vacío para la aspiración de folículos en ovarios de
búfalas faenadas, alcanzando resultados similares a los obtenidos con el método
de slicing, en cuanto a cantidad y viabilidad de
los CCOs, alcanzando estadios trasferibles.
REFERENCIAS
Avalos, I. I., Guevara, O. E., Kjelland, M.,
Espín, L. T., Domínguez, B., & Barrientos, M. (2022). Evaluation of the maturation time of
abattoir-sourced water buffalo (bubalus
bubalis) oocytes fertilized in vitro. Uttar Pradesh Journal of Zoology, 43(12), 30-36. https://researchgate.net/publication/361465212
Dubeibe,
D. F. (2021). Desafios técnicos e biológicos na produção in vitro
de embriões de búfalo. Revista Brasileira de Reprodução Animal, 45(4), 418-425. https://doi.org/10.21451/1809-3000.RBRA2021.056
Kumar, S., Chaves, M. S, Bezerra A. F, Gomes, W., Tavares, S., Ferreira,
J. C., Magalhes, L., & Figuereido,
V. J. (2023). Factors affecting the in vitro embryo production in buffalo (Bubalus bubalis): A review. Veterinary
Medicine, 68(2), 45-56. https://doi.org/10.17221/48/2022-VETMED
Parmar, K. H.,
Raval, R. J., Vala, K. B., & Patbandha T. (2022).
Assessment of oocyte retrieval and its quality from the abattoir ovaries
of jaffarabadi buffaloes by aspiration and slicing
methods. The Indian Journal of Veterinary
Sciences and Biotechnology, 18(3),
35-38. https://doi.org/10.21887/ijvsbt.18.3.8
Pitroda, M. H., Khillare,
K. P., Amle, M. B., Rangnekar,
M. N., Meshram, M. D., & Mali, A. B. (2021).
Recovery of oocytes from ovarian follicles by aspiration method in buffaloes. Journal
of Entomology and Zoology Studies, 9(1), 2124-2129. https://entomoljournal.com/archives/?year=2021&vol=9&issue=1&Articled=8448
Quintana, M. D., Herrera, P., Ramos,
B., & Agüero, F. (2018).
Biotecnología reproductiva aplicada a la mejora genética de Bubalus bubalis en
Cuba. Revista
de Salud Animal, 40(3).
https:/revistas.censa.edu.cu/index.php/RSA/article/view/997
Contribución
de los autores
Concepción y diseño de la investigación:
HNQ, JMSP, CHJ; análisis e interpretación de los datos: HNQ, JMSP, IAP, CHJ,
redacción del artículo: HNQ, JMSP, IAP
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
, José Miguel Sánchez Pellitero
*